הערכת נוגדנים מנטרלים פונקציונליים של SARS-CoV-2

התחל עם סרום אנושי מדולל סדרתי המכיל ריכוזים משתנים של נוגדנים מנטרלים נגד תסמונת נשימתית חריפה חמורה קורונה 2 או SARS-CoV-2.

הציגו נגיפים פסאודוטיפיים עם לוציפראז RNA, אינטגראז וטרנסקריפטאז הפוך, עטופים בתוך שכבת שומנים דו-שכבתית המכילה חלבוני ספייק של SARS-CoV-2.

נוגדנים מנטרלים את הנגיפים על סמך דילול בסרום, כאשר דילולים נמוכים יותר מציגים נטרול מקסימלי.

הציגו תאי מטרה המבטאים קולטני אנזים-2 הממירים אנגיוטנסין או קולטני ACE2 ופרוטאז טרנסממברני סרין-2 או TMPRSS2.

בדילולים גבוהים יותר בסרום, נגיפים לא מנוטרלים מקיימים אינטראקציה עם קולטני ACE2, בעוד TMPRSS2 מבקע את חלבון הספייק, ומאפשר איחוי וירוסים.

עם הכניסה, ה-RNA של לוציפראז עובר העתקה הפוכה ל-DNA המשתלב בגנום המארח ומייצר אנזים לוציפראז.

החלף את המדיום במאגר בדיקה המכיל מצע לוציפראז וחומר ליזינג.

התאים משחררים לוציפראז תוך תאי, המקיים אינטראקציה עם המצע ומייצר זוהר גבוה.

כמת את הזוהר על פני דילול הסרום כדי לקבוע את אחוז נטרול הנגיף - הדילול שמשיג חמישים אחוז נטרול מייצג את טיטר הנטרול.

כדי להתחיל, הוסף 50 מיקרוליטר של DMEM עם 10 אחוז FBS ו-1 אחוז פניצילין-סטרפטומיצין לשורות B עד H, עמודות 1 עד 12 של צלחת לבנה של 96 בארות.

הוסף 5 מיקרוליטר של נסיוב החלמה לבארות בשורה A, עמודות 2 עד 10, בנפח כולל של 100 מיקרוליטר DMEM עם 10 אחוז FBS ו-1 אחוז פניצילין-סטרפטומיצין. הוסף 5 מיקרוליטר של אנטיסרה חיובית ושלילית לבארות A11 ו-A12 כבקרות.

הסר 50 מיקרוליטר מהתמיסה מהבארות בשורה A ובצע דילול סדרתי כפול של כל הבארות שמתחתיה. עבור כל דילול, השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי לערבב את התמיסות 5-10 פעמים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה מבלי ליצור בועות אוויר.

לאחר השלמת הדילול הסדרתי, השליכו את 50 המיקרוליטרים האחרונים מהבאר האחרונה של כל עמודה.

צנטריפוגה את הצלחת למשך דקה אחת ב -500 סיבובים לדקה כדי להבטיח שלא יישאר נוזל על קירות הבאר. חשב את כמות ה-DMEM הנדרשת כדי לדלל את ה-SARS-CoV-2 PV כמתואר בכתב היד של הטקסט.

מערבבים את תמיסת ה-PV המדוללת באגן פיפטה ומכניסים 50 מיקרוליטר לכל באר, למעט בארות A6 עד A12 המרכיבות את הבקרה התאית בלבד. בארות A1 עד A6 משמשות כבקרת PV בלבד.

צלחת צנטריפוגה למשך דקה אחת ב -500 סיבובים לדקה כדי להבטיח שלא יישאר וירוס על קירות הבאר. לאחר מכן, דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5 אחוז פחמן דו חמצני למשך שעה אחת כדי לאפשר לסרום להיקשר לגליקופרוטאין SARS-CoV-2.

לאחר מכן, הכינו צלחת של תאי מטרה HEK 293T/17 שהועברו 24 שעות קודם לכן עם ACE2 ו-TMPRSS2 פלסמידים. הסר את אמצעי התרבות מהצלחת, ושטוף אותו פעמיים עם 2 מיליליטר PBS, על ידי הוספתו לצד אחד של המנה כדי למנוע ניתוק תאים.

השליכו את ה- PBS והוסיפו לצלחת 2 מיליליטר טריפסין. מניחים את הצלחת באינקובטור עד לניתוק התאים.

לאחר ניתוק התאים, הוסף 6 מיליליטר של DMEM עם 10 אחוז FBS ו-1 אחוז פניצילין-סטרפטומיצין לצלחת כדי להרוות את פעילות הטריפסין, ולהשעות את התאים בעדינות.

ספרו את התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי או על ידי ספירת שקופית החדר. הוסף 1 x 10⁴ תאים בנפח כולל של 50 מיקרוליטר לכל באר ודגר את הצלחת ב -37 מעלות צלזיוס עם 5 אחוז פחמן דו חמצני למשך 48 עד 72 שעות.

לאחר הדגירה, הסר את אמצעי התרבות מכל הבארות, והוסף 25 מיקרוליטר של תערובת 1:1 של PBS ומגיב בדיקת לוציפראז מסחרי. קרא את הצלחת באמצעות מערכת בדיקת לוציפראז מסחרית עם לומינומטר מיקרו-פלטה.

באמצעות הנתונים הגולמיים שנוצרו על ידי הלומינומטר, חשב את טיטר הנוגדנים המנטרלים IC50 כמתואר בכתב היד הטקסטואלי.