מדידת רמות G של אימונוגלובולין כנגד חיסון ניסוי בסרום עכברים

התחל עם צלחת מרובת בארות המצופה בחיסון בדיקה וחסום אתרי אינטראקציה לא ספציפיים.

רכוש דגימת סרום מעכבר שהוזרק לו חיסון הבדיקה.

סרום זה מכיל נוגדנים אימונוגלובולין G, או IgG, המזהים את חיסון הבדיקה.

לבארות המצופות בחיסון, הוסף דגימות סרום מדוללות סדרתיות.

ה-IgG נקשרים לחיסון. יש לשטוף כדי להסיר נוגדנים לא קשורים.

הוסף נוגדנים משניים מצומדים לפרוקסידאז הנקשרים ל-IgGs. הסר נוגדנים משניים לא קשורים.

הוסף מצע כרומוגני. הפרוקסידאז מקיים אינטראקציה עם המצע ויוצר מוצר בצבע כחול.

הכניסו חומצה כדי לעצור את התגובה. השינוי ב- pH הופך את התמיסה לצהובה.

בעזרת ספקטרופוטומטר, מדוד את עוצמת הצבע של כל באר כדי לקבוע את ריכוז ה-IgG בדגימת הסרום.

לציפוי אנטיגן של מבחן האימונוסורבנט המקושר לאנזים, או צלחת ELISA, יש לדלל אנטיגן חלבון HI ל-10 מיקרוגרם למיליליטר עם תמיסת ציפוי, ולהוסיף 100 מיקרוליטר מהאנטיגן המדולל לבאר בצלחת ELISA. דגרו את הצלחת בחום של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר הדגירה יש לשטוף את הצלחת עם 300 מיקרוליטר PBST לבאר.

אטמו את הבארות ב -300 מיקרוליטר מתמיסת האיטום לבאר למשך שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, יש לדלל שלושה מיקרוליטרים של נסיוב העכברים מכל קבוצת ניסוי 100 פעמים על ידי הוספת 297 מיקרוליטר של PBST, ולמערבל את הסרום המדולל. הוסף 100 מיקרוליטר של סרום מדולל לבאר בצלחת ELISA המצופה עבור כל דגימת סרום. באופן דומה, יש לדלל את סרום הבקרה החיובי והשלילי 100 פעמים עם PBST, על ידי הוספת 4 מיקרוליטר של סרום בקרה חיובי או שלילי ל-396 מיקרוליטר PBST ואחריו ערבוב מערבולת.

כדי לבצע דילול ביחס כפול, הוסף 200 מיקרוליטר מהסרום הניסיוני המדולל בעבר לשורה הראשונה של צלחת ELISA המצופה. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר PBST לכל הבארות, למעט אלה בשורות 1 ו-12. לאחר מכן, כוונן את אקדח הפיפטה ל -100 מיקרוליטר והעביר 100 מיקרוליטר סרום מהשורה הראשונה לשורה השנייה המכילה PBST.

מערבבים את התוכן בשורה השנייה 10 פעמים, בעזרת אקדח הפיפטה. באופן דומה, בצע דילולים רצופים של 1:2 של הנסיוב עד שורה 11. לאחר שתסיים, השליכו 100 מיקרוליטר נוזלים משורה 11.

הוסף 100 מיקרוליטר של סרום שלילי וחיובי מדולל לכל באר מתאימה בשורה 12, בהתאם לתבנית המדגם. אוטמים את צלחת ELISA בניילון נצמד ודוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. בינתיים, יש לדלל נוגדנים משניים נגד עכבר IgG HRP 10,000 פעמים על ידי הוספת PBST. לאחר הדגירה של שעה, שטפו את צלחת ELISA עם 300 מיקרוליטר PBST לבאר כדי לנקות את הנוגדנים הלא קשורים. לאחר מכן הוסיפו 100 מיקרוליטר של הנוגדן המשני המדולל לכל באר, ודגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות.

שוטפים את הצלחת עם 300 מיקרוליטר PBST, לבאר. לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת פיתוח צבע TMB לכל באר. מניחים את הצלחות בחום של 37 מעלות צלזיוס והרחק מהאור למשך 10 דקות. לאחר מכן, סיים את התגובה מיד עם 50 מיקרוליטר של 2 חומצה גופרתית טוחנת. זהה את הצפיפות האופטית או ערכי ה-OD ב-450 ננומטר, באמצעות סמן אנזים תוך 15 דקות לאחר הסיום.