הערכת פיצול בתיווך קספאז של חלבונים נגיפיים ומארחים בתאים נגועים בנגיף

התחל עם תאי יונקים נגועים בנגיף המייצרים קספזות מרובות, כולל קספאז-3.

הוסף מדיום גידול לבאר הבקרה ומדיום בתוספת מעכב קספאז-3 לבאר הבדיקה.

בבאר הבקרה, קספאז-3 מזהה ומפרק את הנוקליאופרוטאינים הנגיפיים ואת החלבונים המארחים החיוניים להתפשטות הנגיף.

בבאר הבדיקה, המעכב נכנס לתא, מעכב את פעילות הקספאז-3 ומונע פירוק חלבון.

עקור תאים מהצלחת. הוסף מגיב ליזינג וחום כדי לגרום לליזה של תאים, ולשחרר חלבונים תוך תאיים.

טען את שתי הדגימות על ג'ל SDS-polyacrylamide ואלקטרופורזה כדי להפריד חלבונים על סמך גודל.

לאחר אלקטרופורזה, העבירו את הג'ל לקרום סופג.

טפל בממברנה עם נוגדנים ראשוניים כנגד נוקלאופרוטאינים נגיפיים וחלבונים מארחים.

שטפו ושכבו בנוגדנים משניים מצומדים פלואורופור הנקשרים לנוגדנים ראשוניים, ויוצרים רצועות פלואורסצנטיות.

הקרינה הגבוהה יותר בדגימת הבדיקה מצביעה על מחשוף נגיפי וחלבון מארח מופחת בתיווך קספאז-3 בהשוואה לביקורת.

כדי להתחיל, זרעי תאי MDCK או A549 בצלחת תרבית תאים של 12 בארות, דוגרים את התאים למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תחת אטמוספירה של 5% פחמן דו חמצני. למחרת, הסר את מדיום התרבות הישן מהתאים ושטוף את התאים בכל באר פעמיים עם 1 מיליליטר של MEM ללא סרום.

לאחר מכן הדביקו את התאים על ידי הוספת 400 מיקרוליטר של חיסון נגיף שפעת A והניחו את הצלחת לדגירה למשך שעה. לאחר הדגירה, הסר את חיסון הנגיף ושטוף את התאים עם MEM. הוסף 1 מיליליטר של MEM ללא סרום לכל באר, ודגר את התאים כפי שמוצג בשלב הקודם.

לאחר 24 שעות, קצרו את התאים על ידי גירודם בבוכנת מזרק של 1 מיליליטר, והעבירו אותם לצינור של 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה של הצינור ב-12,000 גרם למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר, ואספו את הסופרנטנט. שטפו את גלולת התא עם 250 מיקרוליטר של מי מלח וצנטריפוגה עם פוספט. הסר את הסופרנטנט והוסף 100 מיקרוליטר של מאגר ליזה תאים. מערבבים אחר מערבולת.

מחממים את הצינור בחום של 98 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי ליזות לחלוטין את התאים. לאחר מכן, פתור כמויות שוות של חלבון מדגימות לא נגועות ונגועות על ידי אלקטרופורזה סטנדרטית של ג'ל SDS polyacrylamide. לאחר אלקטרופורזה, העבירו את ג'ל החלבון לקרום ניטרוצלולוז או PVDF ובצעו כתמים מערביים. השווה את רמות החלבון בנתיבי הדגימה הנגועים שטופלו במדמה וטופלו במעכבים.