בדיקה למדידת הצטברות של בדיקה אנטיביוטית פלואורסצנטית בתאי חיידקים

קח מבחנות המכילות דגימות חיידקים.

בדגימת הבדיקה, הוסף מולקולות מעכבות כדי לחסום את משאבת הפליטה האנטיביוטית של החיידקים.

צנטריפוגה והשליכו את הסופרנטנט.

הוסף בדיקות אנטיביוטיות מצומדות פלואורופור שנכנסות לתאי החיידקים.

בדגימת הבקרה, משאבת הפליטה מוציאה את הבדיקות לתווך החוץ-תאי.

בדגימה המטופלת במעכב, משאבת הפליטה החסומה אינה יכולה להוציא את הבדיקות, וגורמת להצטברותם.

צנטריפוגה את הדגימות. השליכו את הסופרנטנט המכיל בדיקות חוץ-תאיות.

הוסף מאגר ליזה ואחריו ליזוזים כדי להחליש את דופן התא החיידקי.

בצע מחזורי הקפאה-הפשרה, סוניקציה וחשיפה לטמפרטורה גבוהה כדי ליז את התאים.

צנטריפוגה. העבירו את הסופרנטנט לקרום פילטר.

שוטפים ואוספים את המסנן המכיל את הבדיקות.

מדוד את עוצמת הקרינה של המסנן.

עוצמת פלואורסצנטיות גבוהה יותר בדגימות חיידקים שטופלו במעכבים מצביעה על אובדן תפקוד הפליטה, מה שמוביל להצטברות בדיקה תוך תאית.

לניתוח הצטברות בדיקה, פס את מלאי הגליצרול של זני החיידקים על צלחות אגר LB לדגירה של לילה ב-37 מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, בחרו מושבה אחת מהצלחת לתרבית לילה במרק ליזוגני בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, יש לדלל את תרבית הלילה בערך פי 50 במדיום טרי.

כאשר התרבית מגיעה לשלב אמצע העץ, גלולה את החיידקים על ידי צנטריפוגה ושפכה את המדיום. השעו מחדש את החיידקים ב-1 מיליליטר של PBS, וצנטריפוגה שוב את החיידקים. שפכו את הסופרנטנט, והשעו מחדש את הגלולה השטופה ב-PBS לצפיפות אופטית של 600 ננומטר של שתיים.

הוסיפו 10.1 מיקרוליטר של CCCP של 10 מילי-מולרי ב-PBS למיליליטר אחד של חיידקים, ודגרו על החיידקים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. בתום הדגירה, אספו את החיידקים על ידי צנטריפוגה, והשעו מחדש את הגלולה ב-1 מיליליטר של תמיסת אנטיביוטיקה פלואורסצנטית של 10 עד 100 מיקרו-מולרית ב-PBS.

לאחר דגירה של 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, יש לשטוף את התאים בצנטריפוגה ארבע פעמים במיליליטר אחד של PBS קר לכל שטיפה. לאחר הכביסה, יש ליז את החיידקים עם 180 מיקרוליטר של מאגר ליזה, ו-70 מיקרוליטר ליזוזים.

לאחר 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, הקפיאו והפשירו את החיידקים שלוש פעמים במינוס 78 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ו-34 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות בהתאמה. לאחר סבב ההקפאה האחרון, סוניקציה של הדגימה למשך 20 דקות, ולאחר מכן דגירה של 30 דקות ב-65 מעלות צלזיוס.

בתום הדגירה, אוספים את הדגימה הליזה על ידי צנטריפוגה, ומסננים את תכולת הצינור דרך קרום פילטר של 10 קילודלטון. שטפו את המסנן ארבע פעמים עם 100 מיקרוליטר מים בכל שטיפה, והעבירו כל שטיפה לבארות נפרדות של צלחת שחורה עם תחתית שטוחה של 96 בארות. לאחר מכן מדוד את עוצמת הקרינה בקורא צלחות עם אורכי גל עירור ופליטה המתאימים לפלואורופור.