בידוד תאי T רוצחים טבעיים אינווריאנטיים ממודל עכבר
JoVE Encyclopedia of Experiments
אימונולוגיה
0 צפיות • 3:35 דק' • July 8th, 2025
התחל בהזרקה תוך-צפקית של גליקוליפיד סינתטי לעכבר.
תאים מציגי אנטיגן, או APCs, מפנימים את הגליקוליפיד ומציגים אותו באמצעות מולקולת MHC הלא קלאסית CD1d.
ה-APCs נודדים לטחול ומקיימים אינטראקציה עם תאי ה-T הרוצחים הטבעיים הקבועים או תאי iNKT, וגורמים להפעלה והתפשטות של תאי iNKT.
קציר את הטחול. נתק אותו מכנית כדי ליצור מתלה של תא יחיד.
העבירו את התאים לצינור. הוסף מדיום שיפוע צפיפות וצנטריפוגה כדי להפריד בין הלימפוציטים.
אוספים את הלימפוציטים. הוסף טטרמרים CD1d עם תווית פלואורופור עמוסים באנטיגן גליקוליפיד המקיימים אינטראקציה עם תאי iNKT.
הסר טטרמרים לא קשורים. כיסוי עם מיקרו-חרוזים מגנטיים הנקשרים לפלואורופורים המקושרים לטטרמר.
הסר חרוזים לא קשורים והעמיס את מתלה התאים על עמוד מגנטי.
תחת השדה המגנטי, תאי ה-iNKT הקשורים לחרוזים נשמרים בעמודה בעוד התאים הנותרים זורמים דרכם.
הסר את העמוד מהשדה המגנטי. הוסף מאגר פליטה כדי להוציא את תאי ה-iNKT.
הזרקת עכבר DBA/1 תקין תוך צפקי עם אלפא-GalCer, במינון של 0.1 מיליגרם לק"ג משקל גוף. שלושה ימים לאחר הדוגמנות, לאחר הרדמה, יש לבודד את הטחול של העכבר. הכן מתלה חד תאי על ידי חיתוך וטחינה של הטחול במסננת של 200 רשת. שטפו את מתלה התא עם PBS. צנטריפוגה בחום של 200 פעמים גרם למשך 5 דקות, והשליכו את הסופרנטנט.
השעו מחדש את התאים עם 1 מיליליטר של תמיסת דילול דם מלא ורקמות. הוסף 3 מיליליטר של מדיום הפרדת לימפוציטים של עכבר, ואז צנטריפוגה את התאים למשך 20 דקות, בטמפרטורה של 300 פעמים גרם, בטמפרטורת החדר.
כדי לטהר את תאי ה-iNKT, השהה מחדש 10 עד 7 תאים עם 100 מיקרוליטר של 4 מעלות צלזיוס PBS. הוסף 10 מיקרוליטר של CD1d Tetramer-PE טעון אלפא GalCer ודגר אותם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות בחושך. שטפו את התאים פעמיים עם PBS, והשעו אותם מחדש ב -80 מיקרוליטר PBS. הוסף 20 מיקרוליטר של מיקרו-חרוזים נגד PE ודגר אותם בחום של 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות בחושך. שטפו אותם פעמיים עם PBS והשעו מחדש את התאים עם 500 מיקרוליטר PBS.
הנח את עמודת המיון בשדה המגנטי של סדרן ה-MACS, ושטוף עם 500 מיקרוליטר PBS. הוסף את תרחיף התאים המוכן לעמודת המיון, אסוף את הזרימה ושטוף שלוש פעמים עם מאגר PBS. הסר את השדה המגנטי והוסף 1 מיליליטר של מאגר PBS לעמודת המיון. דחף במהירות את הבוכנה בלחץ קבוע כדי לדחוף את התאים המסומנים לתוך צינור האיסוף, ולהשיג את תאי ה-iNKT המטוהרים. ספור עם מונה סלולרי אוטומטי.
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה לבידוד תאי T killer natural אינווריאנטיים (iNKT) מרקמת טחול של עכבר. התהליך כולל שימוש בגליקוליפיד סינתטי ובטכניקות סימון ספציפיות כדי לטהר את תאי ה-iNKT לצורך מחקר נוסף.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- אימונולוגיה
- ביולוגיה של התא
- מדעי המוח
רקע
- תאי T killer naturally invariant (iNKT) ממלאים תפקיד מכריע בתגובות חיסוניות.
- הבנת הפעלת תאי iNKT יכולה לספק תובנות לגבי בקרה חיסונית.
- בידוד של תאי iNKT חיוני לחקר תפקודיהם ומכניזמי הפעולה שלהם.
- שימוש בגליקוליפידים כאנטיגנים הוא שיטה נפוצה להפעלת תאי iNKT.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה אמינה לבידוד תאי iNKT מטחול של עכבר.
- סיוע בחקר הביולוגיה של תאי iNKT ותפקידם בתגובות חיסוניות.
- אספקת פרוטוקול שניתן לשחזר במסגרות מחקר אחרות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הזרקה תוך-פריטונית של גליקוליפיד סינתטי לעכברים.
- בידוד של הטחול והפקת תרחיף של תאים בודדים.
- שימוש בסבב צנטריפוגה במדרג צפיפות להפרדת לימפוציטים.
- שימוש בטטרמרים של CD1d ומיון מגנטי לטיהור תאי iNKT.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של תאי iNKT באמצעות הפרוטוקול המתואר.
- השגת רמת טוהר גבוהה של תאי iNKT באמצעות מיון מגנטי.
- הדגמת יעילותם של אנטיגנים גליקוליפידיים בהפעלה של תאי iNKT.
- ניתן להתאים את הפרוטוקול לצרכים ניסיוניים שונים.
מסקנות
- השיטה מספקת גישה חזקה לבידוד תאי iNKT.
- התובנות שניתנו עשויות להעמיק את ההבנה של מנגנוני חיסון.
- מחקרים עתידיים יכולים להסתמך על פרוטוקול זה כדי לחקור את תפקודי תאי iNKT.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בידוד מהימן של תאי invariant natural killer T (iNKT) ממודלים של עכברים מאפשר בחינה מדויקת של תפקוד תאי מערכת החיסון ותומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים בתוכניות גילוי ממוקדות אימונולוגיה. יכולת זו היא קריטית לתיקוף מטרות ולביסוס מודלים פרה-קליניים חסונים המנחים מחקרים טרנסלציונליים. תכשירי תאי iNKT בדרגת טוהר גבוהה מקלים על ביצוע בדיקות המשך הניתנות לשחזור, ובכך מגבירים את הביטחון החזוי באסטרטגיות של מודולציה חיסונית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה ישירה של היפותזות חיסוניות המערבות הפעלה ותפקוד של תאי iNKT.
- תומך בהורדת סיכונים מכניסטית על ידי בידוד אוכלוסיות תאים לצורך בחינת מסלולים.
- מסייע בתיקוף תפקודי של מטרות בהקשרים חיסוניים הרלוונטיים למחלה.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מספק תאי iNKT בטוהר גבוה ובסטנדרט אחיד לצורך פיתוח בדיקות וסריקת תרכובות.
- משפר את השחזוריות ואת התוצאות הכמותיות בבדיקות המבוססות על תאי מערכת החיסון.
- מאפשר הכנה ניתנת להרחבה (scalable) של אוכלוסיות תאים מאומתות לצורך שימוש חוזר בפלטפורמה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- תומך בפיתוח של מודלים פרה-קליניים למחקרי מודולציה חיסונית.
- עולה בקנה אחד עם אסטרטגיות של סמנים ביולוגיים תרגומיים על ידי מתן אפשרות לקריאות תפקודיות מתאי iNKT מבודדים.
- מפחית עמימות ביולוגית בתוכניות טיפוליות המכוונות למערכת החיסון.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
פרוטוקול זה לבידוד תאי iNKT מתאים לרצף שבין שלבי הגילוי המוקדמים למחקרים פרה-קליניים, ותומך הן במחקר מונחה-השערות והן בפיתוח בדיקות עבור תוכניות למודולציה חיסונית.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בידוד ובדיקה תפקודית של תאי iNKT לצורך תיקוף של מסלולים ומטרות.
- סריקה: מספקת קלטים מדידים וניתנים לשחזור למסכים מבוססי תאים לצורך הערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת פלטי מדידה, כגון ספירת תאים ורמת טוהר, לצורך השוואות בין תנאים שונים.
- מחקר טרנסלציונלי: מגשר בין שלב הגילוי למחקרים פרה-קליניים על ידי אספקת אוכלוסיות של תאי מערכת החיסון הרלוונטיות למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס תהליך עבודה סטנדרטי שניתן להתאימו לתוכניות מחקר שונות של תאי מערכת החיסון.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף של מטרות חיסוניות.
- ערך תפעולי: מספק בידוד תאים סטנדרטי, הניתן לשחזור ובניי למספרים גדולים עבור תהליכי עבודה המשכיים.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת ההחלטות לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) ואת יעילות ההון בתיקי השקעות ממוקדי חיסון.
- השפעה על תיק הנכסים: מאפשר תעדוף מותאם סיכונים של נכסי מודיולציה חיסונית.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות באימונולוגיה ובטכניקות לבידוד תאים.
- נדרש גישה לציוד לציטומטריה זרימה, מיון מגנטי וספירת תאים.
- נדרשת סטנדרטיזציה בין צוותים להבטחת הדירות והשוואתיות של הנתונים.
- ניתן להתאימה למודלים שונים של עכברים, אך ייתכן שיידרש אופטימיזציה של הפרוטוקול עבור זנים שונים.
- תלוי בזמינות של ריאגנטים ספציפיים כגון אנטיגנים גליקוליפידיים וטטרמרים מסומנים.
שאלות נפוצות בביופארמה
שיטה אופטימלית עבור בידוד והרחבת תאי Invariant הטבעי רוצח T מטחול העכבר
סרטונים קשורים
0 צפיות
המשלבים Cytometry זרימה הדמיה Transcriptomic פרופיל כדי להעריך שינו CD1d Endocytic סחר
סרטונים קשורים
0 צפיות
טיהור והתרחבות של עכבר Invariant טבעי רוצח תאי T עבור במבחנה ו in vivo מחקרים
סרטונים קשורים
0 צפיות
בידוד של תאים מסוג CD4 + T מ בלוטות לימפה עכבר באמצעות טיהור Miltenyi MACS
סרטונים קשורים
0 צפיות
בידוד תאי הרג טבעי מרקמת הכבד להרחבה סלקטיבית
סרטונים קשורים
0 צפיות
בידוד תאי חיסון חודרי גידול ממוח מוריני
סרטונים קשורים
0 צפיות
העכבר נאיבי CD4
סרטונים קשורים
0 צפיות
שיטת תשואה יעילה גבוהה עבור בידוד של תת תא העכבר דנדריטים
סרטונים קשורים
0 צפיות
לימפוציטים בידוד מן העכבר קטן המעי המערכת החיסונית
סרטונים קשורים
0 צפיות
בידוד של תאי לימפה מולדים ברחם לניתוח על ידי ציטומטריית זרימה
סרטונים קשורים
0 צפיות
עודכן לאחרונה: 22 אוגוסט 2026