הדבקת מקרופאגים ראשוניים עם mRNA שונה

התחל עם צינור המכיל mRNA מתומלל במבחנה המקודד חלבונים פלואורסצנטיים ירוקים.

ה-mRNA מכיל נוקלאוטידים מותאמים, 5-מתיל-ציטידין טריפוספט ופסאודורידין טריפוספט, המונעים תגובה חיסונית ומשפרים את יציבות ה-mRNA.

קצה ה-5' של ה-mRNA הוא דה-זרחני, ומונע את זיהויו על ידי קולטני זיהוי דפוסים על מקרופאגים.

הוסף ריאגנט טרנספקציה מבוסס ליפידים קטיוני ל-mRNA, מה שמקל על אנקפסולציה של ה-mRNA באמצעות אינטראקציות אלקטרוסטטיות ויצירת קומפלקס.

הכניסו את קומפלקסי השומנים-mRNA לצלחת מרובת בארות עם מקרופאגים ראשוניים שמקורם בעכבר דבוקים וערבבו בעדינות לערבוב אחיד.

המקרופאגים מפנימים את הקומפלקס המכיל mRNA לאנדוזום. מאוחר יותר, הקומפלקס מתמזג עם הממברנה האנדוזומלית, ומשחרר את ה- mRNA לציטופלזמה של התא.

זנב הפולי-A בקצה ה-3' מייצב את ה-mRNA שעובר סינתזת חלבון לייצור חלבונים פלואורסצנטיים ירוקים.

תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, פלואורסצנציה ירוקה בתוך המקרופאגים מרמזת על טרנספקציה מוצלחת עם mRNAs ששונו.

התכוננו לטרנספקציה על ידי הוספת הנפח המחושב מראש של מאגר טרנספקציה mRNA מינוס נפחי הנפחים של מגיב טרנספקציה mRNA וה-mRNA לצינור תגובה. מפשירים את ציר ה-mRNA ומערבבים אותו בעדינות על ידי היפוך הצינור. לאחר מכן, הוסף את נפח ה-mRNA המחושב מראש לצינור התגובה.

מערבולת וסובב כלפי מטה את תערובת התגובה ואת מגיב טרנספקציה m