הדבקת מקרופאגים ראשוניים עם mRNA שונה

התחל עם צינור המכיל mRNA מתומלל במבחנה המקודד חלבונים פלואורסצנטיים ירוקים.

ה-mRNA מכיל נוקלאוטידים מותאמים, 5-מתיל-ציטידין טריפוספט ופסאודורידין טריפוספט, המונעים תגובה חיסונית ומשפרים את יציבות ה-mRNA.

קצה ה-5' של ה-mRNA הוא דה-זרחני, ומונע את זיהויו על ידי קולטני זיהוי דפוסים על מקרופאגים.

הוסף ריאגנט טרנספקציה מבוסס ליפידים קטיוני ל-mRNA, מה שמקל על אנקפסולציה של ה-mRNA באמצעות אינטראקציות אלקטרוסטטיות ויצירת קומפלקס.

הכניסו את קומפלקסי השומנים-mRNA לצלחת מרובת בארות עם מקרופאגים ראשוניים שמקורם בעכבר דבוקים וערבבו בעדינות לערבוב אחיד.

המקרופאגים מפנימים את הקומפלקס המכיל mRNA לאנדוזום. מאוחר יותר, הקומפלקס מתמזג עם הממברנה האנדוזומלית, ומשחרר את ה- mRNA לציטופלזמה של התא.

זנב הפולי-A בקצה ה-3' מייצב את ה-mRNA שעובר סינתזת חלבון לייצור חלבונים פלואורסצנטיים ירוקים.

תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, פלואורסצנציה ירוקה בתוך המקרופאגים מרמזת על טרנספקציה מוצלחת עם mRNAs ששונו.

התכוננו לטרנספקציה על ידי הוספת הנפח המחושב מראש של מאגר טרנספקציה mRNA מינוס נפחי הנפחים של מגיב טרנספקציה mRNA וה-mRNA לצינור תגובה. מפשירים את ציר ה-mRNA ומערבבים אותו בעדינות על ידי היפוך הצינור. לאחר מכן, הוסף את נפח ה-mRNA המחושב מראש לצינור התגובה.

מערבולת וסובב כלפי מטה את תערובת התגובה ואת מגיב טרנספקציה mRNA, ואז הוסף את הנפח המתאים של מגיב טרנספקציה mRNA לצינור תערובת התגובה. מערבל את הצינור, סובב אותו כלפי מטה, ואז דגר אותו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. בינתיים, החלף את מדיום התרבות של המקרופאגים במדיום תרבית טרי וחם.

לאחר השלמת הדגירה של תערובת הטרנספקציה, הוסיפו את התערובת לבארות הצלחת המכילות את המקרופאגים בטיפה ובמעגל מבחוץ לאמצע הבאר. כדי להבטיח פיזור אחיד של תערובת הטרנספקציה, נדנד בעדינות את הצלחת בכיוון אנכי ואופקי.

לאחר מכן דגרו את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך שש שעות לפחות. לאחר הדגירה, נתח את יעילות הטרנספקציה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, ציטומטריית זרימה או אימונובלוק.

החלק החשוב ביותר בהליך זה הוא להבטיח פיזור אחיד של תערובת הטרנספקציה כך שכל המקרופאגים יבואו במגע עם אותה כמות של mRNA.