עיכוב מבוסס siRNA של אוטופגיה בתאים דנדריטיים לא בוגרים נגועים בנגיף הרפס סימפלקס

קח שתי קובטות אלקטרופורציה. קובטה אחת מכילה RNA מפריע קטן, או siRNA, שנועד לעכב את הייצור של FIP200, חלבון הגורם לאוטופגיה.

הקובט השני מכיל siRNA מקושקש כבקרה שאינו מעכב את ייצור FIP200.

הוסף תאים דנדריטיים לא בשלים, או iDCs; אלקטרופוראט לכניסה תאית של siRNA ולאחר מכן צלחת התאים.

ה-siRNA המופנם נקשר לקומפלקס השתקה הגורם ל-RNA.

הקומפלקס עם ה-siRNA הספציפי ל-FIP200 מבקע את ה-mRNA המטרה שלו, ומעכב את ייצור FIP200, בעוד שה-iDC שטופלו ב-siRNA מייצרים FIP200.

קצרו את התאים והוסיפו את נגיף ההרפס סימפלקס. עם היתוך קרום מעטפת ויראלי, ה- DNA המשוחרר נכנס לגרעין ומוביל לייצור חלבונים נגיפיים ונוקלאוקפסידים.

חלבונים נגיפיים משבשים את הלמינים הגרעיניים. FIP200 יוצר קומפלקס המפעיל מפל איתות, הגורם לאוטופגיה של הלמינים המופרעים כדי למקד אותם לפירוק ומקל על בריחת נוקלאוקפסידים נגיפיים לציטופלזמה.

עיכוב ייצור FIP200 בתיווך siRNA מגביל את אוטופגיית הלמין, ומונע בריחת נוקלאוקפסיד.

התאים מוכנים להעריך עיכוב אוטופגיה המושרה על ידי siRNA.

ביום ה-3.5 לאחר ההדבקה, העבירו 12 מיליון iDCs לתוך שפופרת של 50 מיליליטר. צנטריפוגה אותם ב -300 פעמים גרם למשך 5 דקות, ואז השליכו את הסופרנטנט. במקביל, בצע ניתוח זרימה ציטומטרי כדי לעקוב אחר מצב ההתבגרות.

שטפו בעדינות את ה-iDCs ב-5 מיליליטר של OptiMEM ללא פנול אדום, וצנטריפוגה אותם ב-300 פעמים גרם למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים ב-200 מיקרוליטר של OptiMEM, והתאימו את ריכוז התאים ל-6 מיליון תאים ל-100 מיקרוליטר.

הוסף 75 פיקמולים של siRNA ספציפי ל-FIP200 או מקושקש לקובטות אלקטרודות של 4 מילימטר והעביר 100 מיקרוליטר של תרחיף התא לקובט המתאים. דופק ישירות את ה-iDCs באמצעות מכשיר אלקטרופורציה.

לאחר האלקטרופורציה, העבירו את ה-iDCs לצלחות של שש בארות עם מדיום DC טרי שחומם מראש, זרעו את התאים בריכוז סופי של מיליון תאים למיליליטר, והניחו אותם באינקובטור. לאחר 48 שעות, בדוק את המורפולוגיה של ה-iDCs האלקטרופוטיים באופן מיקרוסקופי, ואז קצור את התאים עם מגרד תאים, והעביר אותם לצינורות של 15 מיליליטר.

שוטפים את הבארות עם 1 מיליליטר PBS בתוספת 0.01% EDTA ומעבירים את התמיסה לצינורות המתאימים. לאחר מכן, פצלו את התאים עבור כל תנאי siRNA כמתואר בכתב היד.

השתמש ב-500,000 תאים כדי להעריך את מצב ההתבגרות ואת כדאיות התאים. השתמש במיליון תאים לניתוח כתמים מערביים כדי לאמת יעילות נוקדאון ספציפית של 200, והשתמש בתאים הנותרים לניסויי זיהום HSV-1.