JoVE Encyclopedia of Experiments
אימונולוגיה
0 צפיות • 4:42 דק' • July 8th, 2025
קח וקטורים רטרו-ויראליים מעורבבים עם תאי טחול ראשוניים.
הווקטורים מכילים RNA טרנסגני המקודד קולטן אנטיגן כימרי או CAR, המכוון לאנטיגן ספציפי לגידול.
הציטוקין אינטרלוקין-2 במדיה מקדם באופן סלקטיבי את התפשטות תאי ה-T בעוד התאים האחרים מתים בסופו של דבר.
העבירו את התערובת למיקרופלטה המצופה בשברי פיברונקטין רקומביננטיים.
צנטריפוגה כדי להקל על שברי הפיברונקטין הקושרים את הווקטורים ותאי T, מתווכים אינטראקציה בין תא המארח של הנגיף והדגירה.
עם היתוך מעטפת הווקטורים עם קרום התא, האנזימים הוויראליים מתעתקים לאחור את ה-RNA המשוחרר ל-DNA ומשלבים אותו בגנום המארח.
תאי ה-T המומרים מבטאים CARs הקשורים לפני השטח, המורכבים ממקטע משתנה נוגדן חוץ-תאי המכוון לאנטיגן הספציפי לגידול ולאזורי איתות תוך-תאיים כדי להגיב לאנטיגן.
השעו מחדש את התאים לפני העברתם לצינור.
צנטריפוגה כדי להשליך את הסופרנטנט המכיל נגיפים לא מופנמים, ולהשעות מחדש את התאים במאגר לבדיקות במורד הזרם.
ביום שלאחר כריתת הטחול, הכינו PBS המכיל 25 מיקרוגרם למיליליטר שבר פיברונקטין אנושי רקומביננטי או RHFF וצפו צלחות 24 בארות שאינן מטופלות בתרבית רקמות על ידי הוספת 0.5 מיליליטר מהתמיסה לכל באר. למחרת, הסר את התמיסה מהבארות, והוסף 1 מיליליטר לבאר של 2% BSA ב-PBS.
דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, לאחר מכן, הסר את ה-BSA על ידי הפיכת הצלחת בחוזקה לפני הוספת 2 מיליליטר PBS לכביסה. לאחר איסוף הסופרנטנט הנגיפי מהתאים HEK293T, הוסיפו TCM טרי לנפח סופי במיליליטר השווה למספר הבארות המצופות RHFF בתוספת 3 מיליליטר נוספים.
הסר את הטחול המתורבת מהחממה, והשהה מחדש על ידי פיפטינג בעדינות למעלה ולמטה פעמיים עד שלוש בכל באר. העבירו את מתלי התאים לצינור חרוטי של 50 מיליליטר. לאחר מכן, השעו מחדש את הטחול בסופרנטנט הנגיפי ל-1 x 106 תאים למיליליטר.
לאחר מכן, הוסף 1 מיליליטר לבאר של תרחיף הטחול לבארות הלוחות המצופים RHFF. כעת, סובב את הלוחות במשך 90 דקות ב-32 מעלות צלזיוס ו-770 גרםלשנייה עם תאוצה של 4 והגדרת הפסקה של אפס. במהלך הסיבוב, הכינו 50 יחידות בינלאומיות למיליליטר של IL-2 אנושי רקומביננטי ברפואה הסינית המסורתית.
לאחר הסיבוב מוסיפים 1 מיליליטר מהמדיום לכל באר של הצלחות ודוגרים למשך הלילה. אם תאי T מגיעים למפגש של יותר מ-80%, פצלו את התאים על ידי פיפטינג עדין למעלה ולמטה בכל באר, פעמיים עד שלוש, ואז העבירו 1 מיליליטר מכל באר לבארות חדשות של צלחת טרייה של 24 בארות שטופלו בתרבית רקמות.
הוסף 1 מיליליטר של TCM טרי, עם 50 יחידות בינלאומיות למיליליטר של IL-2 לכל באר. אם התאים אינם מגיעים למפגש של יותר מ-80%, החלף מחצית מהמדיום על ידי הוצאה איטית של 1 מיליליטר של מדיום מהחלק העליון של כל באר והחלפתו ב-1 מיליליטר של TCM טרי, המכיל 50 יחידות בינלאומיות למיליליטר של IL-2 אנושי רקומביננטי.
השעו מחדש את תאי ה-T של CAR על ידי פיפטינג עדין למעלה ולמטה שלוש פעמים בכל באר, והעבירו לצינור צנטריפוגה של 250 מיליליטר. סובב את התאים ב -300 גרםלמשך 10 דקות. לאחר מכן שאפו לחלוטין את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור. השתמש ב-PBS כדי לשטוף את התאים, ולאחר מכן ספור אותם לפני הכביסה בפעם השנייה. תפוקת תאי CAR T טיפוסית היא כ-1 x 106 תאים לבאר.