JoVE Encyclopedia of Experiments
אימונולוגיה
0 צפיות • 2:55 דק' • July 8th, 2025
התחל בהשעיה של תאי T וטפל בהם עם נגיפי לנטי CAR הנושאים גן לקולטן האנטיגן הכימרי או CAR ו-CRISPR lentivirus.
וירוס ה-CRISPR מכיל גנים ל-RNA המנחה ונוקלאז Cas9 וכן גן עמידות לאנטיביוטיקה.
גם נגיפי ה-CAR וגם ה-CRISPR מקיימים אינטראקציה עם תאי T ומשחררים את ה-RNA שלהם.
RNAs אלה מתועתקים לאחור ומומרים ל-DNA מתאים, המשתלב ב-DNA של תאי T.
זה מאפשר סינתזה של חלבוני CAR, RNA מנחה וחלבוני Cas9.
ה-RNA המנחה יוצר קומפלקס עם Cas9, המזהה ונקשר באופן ספציפי לגן המטרה ב-DNA של תאי T.
בינתיים, Cas9 מבקע את ה-DNA, ויוצר שבר דו-גדילי.
שבר זה מתוקן באמצעות חיבור קצה לא הומולוגי, מנגנון תיקון מועד לשגיאות, וכתוצאה מכך שינוי גן המטרה.
זה מייצר תאי T מהונדסים גנטית עם קולטני אנטיגן כימריים.
טפל בתאים באנטיביוטיקה כדי לחסל את תאי ה-T הלא מהונדסים ולבודד באופן סלקטיבי את תאי ה-CAR T המהונדסים גנטית.
כדי לשבש את הגורם המגרה מושבת גרנולוציטים-מקרופאגים, השתמש ב-RNA מדריך, כמתואר בכתב היד. דגרו ריאגנטים טרנספקציה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר הדגירה, הוסיפו אותם לתאי 293T שהגיעו למפגש של 70% עד 90%, ותרבו את התאים שעברו טרנספטציה ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 כדי לייצר לנטי-וירוס.
לאחר 24 ו-48 שעות, קצרו ורכזו סופרנטנט המכיל וירוסים על ידי אולטרה-צנטריפוגה בצינורות אולטרה-צנטריפוגה של 50 מיליליטר, והקפאו במינוס 80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי. לאחר מכן, ביום הראשון, השעו בעדינות את תאי ה-T כדי לפרק שושנות.
במעבדה מאושרת BSL-2 plus, כדי ליצור תאי CAR T, הוסף CAR19 lentivirus ו-CRISPR lentivirus המכוון ל-GM-CSF לתאי T מגורים. ביום השלישי וביום החמישי, עבור תאי T שנערכו בהצלחה על ידי lenti-CRISPR הנושאים עמידות לפורומיצין, יש לטפל בתאים עם פורומיצין דיהידרוכלוריד בריכוז של 1 מיקרוגרם פורומיצין למיליליטר.