JoVE Encyclopedia of Experiments
אימונולוגיה
0 צפיות • 2:30 דק' • July 8th, 2025
קחו לדוגמה תאי T תלויים במדיום המתאים לאלקטרופורציה, תהליך שבו פולסים חשמליים יוצרים נקבוביות זמניות בקרום התא.
הוסף קומפלקסים המכילים חלבון Cas9 ו-RNA מדריך יחיד או sgRNA. sgRNA הוא RNA קטן המכוון Cas9, מספריים מולקולריים, למיקום ספציפי ב-DNA לצורך חיתוך.
הוסף מולקולות DNA חד-גדיליות קצרות המסייעות בהובלת קומפלקסי Cas9-sgRNA לתא.
העבירו את התערובת הזו לקובטה והתחילו אלקטרופורציה על ידי הפעלת פולסים חשמליים קצרים.
תהליך זה מאפשר לקומפלקסים להיכנס לתא.
ה-sgRNA נקשר לאתר המטרה ב-DNA של תא T, ומאפשר ל-Cas9 לערוך את ה-DNA, ויוצר שבירה בשני הגדילים.
שיבוש זה מאותת לחלבוני התיקון לאתר.
לאחר מכן חלבוני התיקון מחברים מחדש את הקצוות, מה שהופך את הגן ללא מתפקד.
לדגור את תאי ה-T הערוכים בגנים במדיום מתאים לבדיקות במורד הזרם.
הכן ריבונוקלאופרוטאין, או קומפלקס RNP, על ידי דגירה של 10 מיקרוגרם של נוקלאז Cas9 עם 5 מיקרוגרם של RNA מדריך יחיד למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. כלול בקרה מדומה ללא RNA מנחה יחיד. שלב את תאי ה-T המרחפים עם קומפלקס ה-RNP והוסף 4.2 מיקרוליטר של משפר אלקטרופורציה של 4 מיקרו-מולרי. מערבבים היטב, ומעבירים לקוביות אלקטרופורציה.
אלקטרו את התאים באמצעות קוד דופק EH-1-11. לאחר מכן, דגרו 5 מיליון תאים למיליליטר ב-R-10, בתוספת 5 ננוגרם למיליליטר IL-7 אנושי ו-Il-15 אנושי ב-30 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות בצלחות של 12 בארות. לאחר הדגירה, המשך בהפעלה והתרחבות של תאי T.