יצירת חיסון רב-ערכי נגד שלפוחית הממברנה החיצונית

קח פוליפלקסים טרנספקטיביים המכילים פלסמידים מטרה הקשורים לפולימר. הפלסמידים מקודדים אנטיגן ויראלי המאוחה לתג פפטיד ותג זיקה.

דגרו את הפוליפלקסים עם תאי יונקים, המפנימים את הפוליפלקסים בתוך אנדוזומים.

הפולימר גורם לקרע בשלפוחית. הפלסמידים המשוחררים מבטאים את האנטיגן הנגיפי, המופרש מחוץ לתא.

קצרו את הסופרנטנט המכיל את האנטיגן והמזהמים. הוסף חומר מתחרה בריכוז נמוך.

טען אותו על עמודת כרומטוגרפיה של זיקה.

תגי הזיקה נקשרים לשרף העמודה, ומשתקים את האנטיגן, בעוד שהסוכן המתחרה מקטין את הקישור הלא ספציפי.

הזרם את החומר המתחרה בריכוז נמוך, והסר מזהמים בעלי קשר חלש.

שטפו עם ריכוזי חומרים מתחרים הולכים וגדלים כדי לעקור את האנטיגנים הקשורים חזק, ולסלק אותם.

הכניסו שלפוחיות ממברנה חיצונית חיידקית, או OMVs, עם חלבון לוכד הקשור לפני השטח ודגירה.

תגי פפטיד אנטיגן נקשרים לחלבונים הלוכדים, ויוצרים חיסון OMV עם תצוגת אנטיגן רב-ערכית.

בצע טיהור OMV SpyCatcher. התחל בצנטריפוגה של תמיסת החיידקים. מסננים את הסופרנטנט עם מסנן ממברנה של 0.22 מיקרומטר, ואז מרכזים אותו באמצעות עמוד סיבים חלול. מסננים את התרכיז דרך מסנן ממברנה של 0.22 מיקרומטר, ואז צנטריפוגה אותו ב-150,000 פעמים גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך שעתיים באמצעות אולטרה-צנטריפוגה, והשליכו את הסופרנטנט בעזרת פיפטה. השעו את המשקעים עם PBS ואחסנו אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס.

כדי לבצע טרנספקציה של RBD-SpyTag, התחל בבחירת מערכת ביטוי אוקריוטית מתאימה, ותרבית את התאים למשך הלילה ב-130 סיבובים לדקה ב-37 מעלות צלזיוס לאחר ההתאוששות. הוסף 20 מיקרוליטר HEK293F של תמיסת תאים לדלפק התאים האוטומטי. רשום את מספר התאים. התאם את הריכוז ל -1 כפול 10 לתאים השישיים למיליליטר, ולאחר מכן תרבית את התאים ב -130 סיבובים לדקה ב -37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות.

סנן פלסמיד RBD-SpyTag דרך מסנן ממברנה של 0.22 מיקרומטר והוסף 300 מיקרוגרם פלסמידים למדיום תרבית התאים עד שהנפח הסופי הוא 10 מיליליטר. יש לנער במשך 10 שניות. מחממים PEI ל 65 מעלות צלזיוס באמבט המים. מערבבים 0.7 מיליליטר PEI עם 9.3 מיליליטר מדיום תרבית תאים ומנערים לסירוגין למשך 10 שניות.

הוסף תמיסת פלסמיד לתמיסת PEI. מנערים את התערובת לסירוגין במשך 10 שניות ומדגרים אותה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. מוסיפים את התערובת ל -280 מיליליטר מדיום תרבית תאים ותרבית ב -130 סיבובים לדקה ב -37 מעלות צלזיוס למשך 5 ימים.

לאחר מכן, בצע טיהור RBD-SpyTag. התחל בצנטריפוגה של התאים ב -6,000 פעמים גרם ב -25 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. והשתמש בפיפטה כדי לאסוף את הסופרנטנט. בנה את העמוד עם 2 מיליליטר ניקל-NTA אגרוז ושטוף אותו שלוש פעמים עם PBS.

הוסף אימידזול לתוך הסופרנטנט של התא כדי ליצור את הריכוז הסופי של 20 מילי-מולרי ולהעמיס את התא על העל. הוסף 3 נפחי עמודות של PBS המכילים 20 מילימולר של אימידזול לכביסה ואסוף את שבר הכביסה. שיפוע עם שלושה נפחי עמודות של PBS המכילים ריכוזים נמוכים עד גבוהים של אימידזול. יש להוציא פעמיים עבור כל ריכוז.

כדי לקבוע את ריכוז החלבון בשיטת BCA, יש לדלל באופן סדרתי את תמיסת החלבון הסטנדרטית BSA מ-2 ל-0.0625 מיליגרם למיליליטר. יש לדלל את ה-OMV SpyCatcher ו-RBD-SpyTag המטוהרים 10 פעמים. לאחר מכן, ערבבו פתרונות עבודה BCA A ו-B ביחס של 50 ל-1. מוסיפים תמיסת חלבון מדוללת ומערבבים עם תמיסת עבודה BCA. דגירה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. מדוד את הספיגה ב-562 ננומטר של כל באר, וחשב את ריכוז החלבון מהעקומה הסטנדרטית.

כדי לבצע צימוד ביולוגי של OMV SpyCatcher ו-RBD-SpyTag, ערבב את OMV SpyCatcher ב-RBD-SpyTag ב-PBS ביחס של 40 ל-1. סובבו אנכית כדי לערבב את התערובת למשך הלילה ב-15 סיבובים לדקה ב-4 מעלות צלזיוס. בצע טיהור של OMV RBD באמצעות פתרון PBS באמצעות הליך דומה לטיהור OMV SpyCatcher.