JoVE Encyclopedia of Experiments
אימונולוגיה
0 צפיות • 4:22 דק' • July 8th, 2025
קח תערובת של CRISPR RNA, או crRNA, ו-crRNA או tracrRNA מפעילים טרנס.
מחממים את התערובת ומניחים לה להתקרר, מה שמקל על זיווג הבסיס של tracrRNA עם crRNA ליצירת RNA מנחה, או gRNA.
הוסף מספריים מולקולריים הנקראים אנזימי Cas9 הנקשרים ל- gRNA ויוצרים קומפלקסים.
הוסף את קומפלקסי Cas9-gRNA לתאי Natural Killer או NK המרחפים בתמיסת אלקטרופורציה.
הציגו מולקולות DNA חד-גדיליות המסייעות בהובלת קומפלקסים של Cas9-gRNA.
מעבירים את התערובת לקובטה ומבצעים אלקטרופורציה, ויוצרים נקבוביות זמניות בקרום כדי שהקומפלקסים ייכנסו לתא.
ה-gRNA נקשר לאתר המטרה בגנום, ומאפשר ל-Cas9 לבקע את ה-DNA.
חלבוני תיקון נקשרים באתר השבירה ומצטרפים ל-DNA, ולעתים קרובות גורמים לשגיאות הכנסה או מחיקה של זוג בסיסים. השינוי שנוצר משבש את גן המטרה, מה שהופך אותו ללא מתפקד.
להעביר את התאים המהונדסים גנטית למדיום מתאים להמשך ניתוח.
ביום האלקטרופורציה, מלאו בקבוק T25 אחד ב-8 מיליליטר של מדיום תרבית טרי בתוספת 100 יחב"ל למיליליטר IL-2 לכל מצב תא ניסוי, והניחו את הצלוחיות באינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.
בזמן שהמדיום מתאזן, הוסף 3 עד 4 x 106 תאים לכל מצב, לכל 26 מיקרוליטר של תערובת התמרה לצינור חרוטי, וגלול את התאים על ידי צנטריפוגה. לאחר מכן, שטפו את התאים שלוש פעמים ב-12 מיליליטר של PBS סטרילי בכל שטיפה כדי להסיר את כל ה-FBS ממתלי התאים.
בזמן שטיפת התאים, השעו מחדש כל RNA של CRISPR ו-Tracer RNA לריכוזים סופיים של 200 מיקרו-מולרים. מערבבים 2.2 מיקרוליטר מכל RNA CRISPR עם נפח אחד של 200 מיקרומולרית של RNA עוקב לכל דגימה ומחממים את הדגימות בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. לאחר מכן, הניחו לדגימות להתקרר לטמפרטורת החדר, ואחסנו את קומפלקסי ה-RNA של CRISPR בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס עד לשימוש בהם.
כדי ליצור את קומפלקסי הריבונוקלאופרוטאין, הוסף אנדונוקלאז Cas9 לקומפלקס ה-RNA המתאים של CRISPR RNA - tracer עם מערבולת של 30 עד 60 שניות, ודגר את קומפלקסי הריבונוקלאופרוטאין Cas9 המתקבלים בטמפרטורת החדר למשך 15 עד 20 דקות.
לאחר הכביסה האחרונה, הוסף את כל נפח תוסף האלקטרופורציה מערכת P3 של תמיסת Nucleofector והשהה מחדש כל כדור תא ב-20 מיקרוליטר של תמיסת ה-P3D-Nucleofector הראשונית, תוך הקפדה על הימנעות מבועות אוויר.
הוסף מיד 5 מיקרוליטר מכל קומפלקס ריבונוקלאופרוטאין לתרחיף התאים המתאים, והוסף 1 מיקרוליטר של משפר אלקטרופורציה Cas9 מיקרו-מולרי לתערובת התאים המורכבת של ריבונוקלאופרוטאין Cas9. העבירו 26 מיקרוליטר מתמיסת התא ריבונוקלאופרוטאין Cas9 לבארות בודדות של רצועת נוקלאוקובט, והקישו בעדינות על הרצועה כדי לוודא שהדגימות מכסות את החלק התחתון של כל באר.
לאחר מכן, התחל את תוכנית מערכת 4D-Nucleofector EN-138. בתום ההתמרה תנו לתאים לנוח במשך שלוש דקות. לאחר מכן, הוסף 80 מיקרוליטר ממדיום התרבית המאוזנת מראש לכל קובטה, והעביר בעדינות את הדגימות לבקבוק אחד לכל מצב בדגירה של 37 מעלות צלזיוס.