אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
אימונולוגיה
0 צפיות • 4:22 דק׳ • July 8th, 2025
קח תערובת של CRISPR RNA, או crRNA, ו-crRNA או tracrRNA מפעילים טרנס.
מחממים את התערובת ומניחים לה להתקרר, מה שמקל על זיווג הבסיס של tracrRNA עם crRNA ליצירת RNA מנחה, או gRNA.
הוסף מספריים מולקולריים הנקראים אנזימי Cas9 הנקשרים ל- gRNA ויוצרים קומפלקסים.
הוסף את קומפלקסי Cas9-gRNA לתאי Natural Killer או NK המרחפים בתמיסת אלקטרופורציה.
הציגו מולקולות DNA חד-גדיליות המסייעות בהובלת קומפלקסים של Cas9-gRNA.
מעבירים את התערובת לקובטה ומבצעים אלקטרופורציה, ויוצרים נקבוביות זמניות בקרום כדי שהקומפלקסים ייכנסו לתא.
ה-gRNA נקשר לאתר המטרה בגנום, ומאפשר ל-Cas9 לבקע את ה-DNA.
חלבוני תיקון נקשרים באתר השבירה ומצטרפים ל-DNA, ולעתים קרובות גורמים לשגיאות הכנסה או מחיקה של זוג בסיסים. השינוי שנוצר משבש את גן המטרה, מה שהופך אותו ללא מתפקד.
להעביר את התאים המהונדסים גנטית למדיום מתאים להמשך ניתוח.
ביום האלקטרופורציה, מלאו בקבוק T25 אחד ב-8 מיליליטר של מדיום תרבית טרי בתוספת 100 יחב"ל למיליליטר IL-2 לכל מצב תא ניסוי, והניחו את הצלוחיות באינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.
בזמן שהמדיום מתאזן, הוסף 3 עד 4 x 106 תאים לכל מצב, לכל 26 מיקרוליטר של תערובת התמרה לצינור חרוטי, וגלול את התאים על ידי צנטריפוגה. לאחר מכן, שטפו את התאים שלוש פעמים ב-12 מיליליטר של PBS סטרילי בכל שטיפה כדי להסיר את כל ה-F
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים