יצירת נגיפי שפעת חיים מוחלשים רקומביננטיים לחיסונים

התחל עם פלסמידים דו-כיווניים הנושאים cDNA המקודד חלבונים חיוניים נגיפיים מסוימים של זן שפעת מותאם לקור.

הציגו קבוצה חדשה של פלסמידים דו-כיווניים המכילים המגלוטינין ו-cDNA נויראמינידאז שונה מזן שפעת אחר.

הכניסו מגיב טרנספקציה לתערובת זו ודגרו ליצירת קומפלקס עם הפלסמידים.

העבר את הקומפלקסים הללו לתאים דמויי אפיתל אנושיים מתורבתים כדי לאפשר כניסת פלסמיד לתא.

הפלסמידים הדו-כיווניים עם שני מקדמים בכיוונים מנוגדים מאפשרים ייצור של חלבונים נגיפיים וה-RNA המתאים להם.

דגירה על התאים בטמפרטורה נמוכה יותר.

החלבונים הנגיפיים וה-RNA הנגיפי מתאספים בעצמם ליצירת נגיפי שפעת רקומביננטיים מותאמים לקור עם שכפול מופחת בתנאים חמים יותר.

שכבה עם תאי MDCK המבטאים יתר על המידה חומצה סיאלית ואנזימי טריפסין מותאמים המאפשרים התקשרות וכניסה של הנגיף לתוך התאים.

דגירה באותה טמפרטורה כדי לגרום לשכפול וייצור של נגיפים חדשים.

צנטריפוגה וקצור את נגיפי השפעת החיים המוחלשים הרקומביננטיים המוכנים להכנת חיסון.

כדי להתחיל, צלח מיליון תאי 293T בכל באר של צלחת של 6 בארות עם DMEM המכיל 10% סרום בקר עוברי ו-1% סטרפטוקוס עט. לאחר מכן, הכינו מספיק תערובת טרנספקציה של פלסמיד ל -100 מיקרוליטר לבאר. שלב מיקרוגרם מכל פלסמיד ומלא את הצינור במדיום תא Opti-MEM מחומם מראש עד 50 מיקרוליטר. בשפופרת אחרת, הוסף פי שניים מהנפח של ליפופקטמין 2000 המתאים לכמות הכוללת של הפלסמיד שיש להעביר, ומלא את הצינור ל-50 מיקרוליטר עם Opti-MEM.

לפני הוספת תערובת הטרנספקציה לתאים, הניחו לה לשבת 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסיפו 100 מיקרוליטר מתערובת הטרנספקציה לכל באר והעבירו את הצלחת לחממה למשך 16 שעות. למחרת, שנה את המדיום ל-DMEM עם 0.3% BSA ו-1% עט סטרפטוק. ולאחר מכן. העבירו את התאים ל -33 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך חמש שעות.

לאחר חמש שעות, הוסף שכבת-על של מיליון תאי MDCK מתירניים לשפעת ב-DEM בתוספת טריפסין. שמור על התרביות המשותפות במשך 2 עד 3 ימים תחת משטר הדגירה של 33 מעלות צלזיוס כדי ליצור ולהגביר את הנגיף. מאוחר יותר, פנו את הפסולת באמצעות סיבוב של 260 גרם של חמש דקות, ואז אספו את הסופרנטנטים.