Name: זיהוי של שינויים היסטון בעלים הצמח (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: למדו שיטת ChIP לזיהוי שינויים בהיסטונים בגנים ספציפיים בצמחים. הפרוטוקול משלב חציבה כרומטין ו-PCR כמותי בזמן אמת לחקירת מנגנוני ויסות גנים ב-Arabidopsis.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> עבודה זו מומנה על ידי קרן המדע הגרמנית (DFG) ויוזמת מצוינות של ממשלות פדרליות ואת המדינה הגרמנית. </p>

<p class="jove_title" style=";text-align:right;direction:rtl"> 1. Crosslinking של חומר צמחי </p><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר 1-2G עלים ארבידופסיס (6 לקוטר שושנת 10 ס"מ) בתוך שפופרת 50 מ"ל פלסטיק למלא עד 40mL עם חיץ crosslinking. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא עלים להישאר שקוע, למשל על ידי מלית זכות המותאמים ספוג לסנן מעל פני השטח חיץ. אז במקום צינורות ייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אבק לחדור עבור 10min. כדי להוסיף צינור כל 2.5mL של גליצין 2M להפסיק crosslinking, וכן להפוך צינורות כדי להצדיק פיזור שווה של גליצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אבק לחדור עבור 5min נוסף וזורקים נוזל תוך קצירת העלים על מסננת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו פעמיים עם העלים 1 ליטר של מים בכוס זכוכית, אז העלים היבשים ביסודיות בעזרת מגבות נייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף העלים בצינור פלסטיק טריים להקפיא בחנקן נוזלי. חנות יוצאת בשעה -80 ° C עד הבידוד הכרומטין. </li></ol><p class="jove_title" style=";text-align:right;direction:rtl"> 2. בידוד של הכרומטין </p><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עלים היו הקרקע עם מרגמה פיסטיל כי הוחזקו חנקן נוזלי עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת אבקת שפופרת 50 מ"ל פלסטיק להשעות במאגר מיצוי 30 מ"ל # 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עבור 15min ב 4 ° C על שייקר תקורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תסנין ההשעיה דרך ארבע שכבות של miracloth לתוך צינור 50 מ"ל טרי פלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין עבור 20min XG ב 2800 ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant ו להשעות גלולה עם מברשת צבע במאגר מיצוי 1mL # 2. ראשית להוסיף נפח קטן של חיץ # 2, אז להשעות גלולה עם מברשת צבע, ולאחר מכן להוסיף את שאר חיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת ההשעיה לצינור microfuge ספין 1.5mL עבור 10min ב XG 12,000 ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים, להכין 2ml-microfuge צינורות המכיל מאגר מיצוי 1.5mL # 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant מהצינור סובב (שלב 2.7) ו להשעות גלולה ב 300μL של חיץ מיצוי # 3. ראשית להוסיף נפח קטן של חיץ # 3, להשעות גלולה עם מברשת צבע, ולאחר מכן להוסיף את המאגר הנותרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות pipet מושעה גלולה (שלב 2.9) על גבי החיץ 1.5 מ"ל מיצוי # 3 מוכן בשלב 2.8. ודא כי שני השלבים לא לערבב. ספין עבור 1h ב XG 16,000 ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant ו להשעות הכרומטין גלולה עם מברשת צבע 300μL של חיץ sonication. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate הכרומטין עם sonotrode, או באמבטיה קולי, לגודל ה-DNA של 400bp כ. כאשר sonicating, לעשות הכרומטין בטוח לא יהיה מחומם מעל כ -30 ° C כדי להגן רגישים לחום crosslinks. משך sonication צריך להיקבע באופן ניסיוני, כי זה משתנה באופן משמעותי בין התקנים sonication שונים. לקבלת הדרכה, ההגדרות עבור שני מכשירים שונים ניתנים: </li></ol><p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור sonication עם sonotrode המותג Bandelin לחשוף הכרומטין בצינור microfuge 0.6mL חמש פעמים עד 20 התפרצויות עם הגדרות 25%, מחזור כוח = 50. תוך כדי כך, מדגם מגניב אחרי כל 20 התפרצויות <sup>ה</sup> באמבט קרח. </p><p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור sonication עם אמבטיה Diagenode Bioruptor קולי, למלא אמבטיה עם מים וקרח sonicate עשר פעמים במשך 30 שניות בתוך צינורות microfuge 1.5mL עם ההגדרה "גבוה". אחרי כל 30 שניות, דגימות מגניב עוד 30 שניות. </p><ol start="13" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין sonicated מדגם עבור 5min ב g 16,000 ב 4 ° C כדי לזרז חומר שלא נמס. Supernatant יכול ישירות לשמש immunoprecipitation. לחלופין, ניתן דגימות הלם קפוא בחנקן נוזלי המאוחסן ב -80 ° C עד לשימוש נוסף. </li></ol><p class="jove_title" style=";text-align:right;direction:rtl"> 3. Immunoprecipitation </p><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 2-mL צינורות microfuge המכיל חלבון 40μL agarose ו 1.8mL של חיץ נוגדן מחייב. הוסף 200μL של הכנת הכרומטין (שלב 2.13). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צינורות עבור 1h על שייקר תקורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל חלבון חרוזים agarose ולהשתמש supernatant עבור immunoprecipitation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת 40μL-aliquot כדי לקבוע ריכוז הכרומטין ("קלט"). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 30μL חלבון agarose ואת כמות הנוגדנים שינוי ספציפי זה המצוין בטבלה שלהלן של ריאגנטים ספציפיים וציוד ההשעיה 400μL הכרומטין sonicated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עבור 2.5h או לילה על שייקר תקורה ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה חרוזים עבור 2min ב 440 x ז </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם חרוז גלולה 900μL של חיץ כל לשטוף (ראה רשימה להלן). במשך כל חיץ, חרוזים דגירה במאגר עבור 10min על שייקר ממעל על 4 מעלות צלזיוס, אז בשביל ספין 2min ב XG 440, להשליך supernatant, ולהוסיף את המאגר הבא. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלח נמוכה לשטוף חיץ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלח גבוהה לשטוף חיץ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> LiCl לשטוף חיץ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> TE לשטוף חיץ </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לשטוף הסופי, להסיר לחלוטין כל חיץ הנותרים. </li></ol><p class="jove_title" style=";text-align:right;direction:rtl"> 4. De-crosslinking של היסטונים ו-DNA, וטיהור של ה-DNA זירז </p><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100μL של חיץ דה crosslinking של גלולה agarose מדגם "קלט" את 40μl משלב 3.4, תערובת של 5min על מערבל מערבולת, דגימות ספין, incuבייט ב 65 ° C במשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר DNA עם DNA מסחרי או ערכת טיהור PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדרך כלל 5μl של דילול של 1:05 eluate הטור הסופי מספיקים כדי לבצע קונבנציונאלי מוקד ספציפי בזמן אמת כמותי RT-PCR (RT-qPCR). </li></ol><p class="jove_title" style=";text-align:right;direction:rtl"> 5. טבלה של מאגרים </p><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>Crosslinking חיץ</strong> </td></tr><tr><td> סודיום בוטיראט </td><td> 10mm </td></tr><tr><td> סוכרוז </td><td> 400mm </td></tr><tr><td> טריס-HCl, pH 8.0 </td><td> 10mm </td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol </td><td> 5mm </td></tr><tr><td> פורמלדהיד </td><td> 3% (V / V) </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>הפקת המאגר # 1</strong> </td></tr><tr><td> סודיום בוטיראט </td><td> 10mm </td></tr><tr><td> סוכרוז </td><td> 400mm </td></tr><tr><td> טריס-HCl, pH 8.0 </td><td> 10mm </td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol </td><td> 5mm </td></tr><tr><td> מעכבי פרוטאז השלם </td><td> 1x </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>הפקת המאגר # 2</strong> </td></tr><tr><td> סודיום בוטיראט </td><td> 10mm </td></tr><tr><td> סוכרוז </td><td> 250mm </td></tr><tr><td> טריס-HCl, pH 8.0 </td><td> 10mm </td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol </td><td> 5mm </td></tr><tr><td> MgCl <sub>2</sub> </td><td> 10mm </td></tr><tr><td> טריטון X-100 </td><td> 1% (w / v) </td></tr><tr><td> מעכבי פרוטאז השלם </td><td> 1x </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>הפקת המאגר # 3</strong> </td></tr><tr><td> סודיום בוטיראט </td><td> 10mm </td></tr><tr><td> סוכרוז </td><td> 1.7M </td></tr><tr><td> טריס-HCl, pH 8.0 </td><td> 10mm </td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol </td><td> 5mm </td></tr><tr><td> MgCl <sub>2</sub> </td><td> 2mm </td></tr><tr><td> טריטון X-100 </td><td> 0.15% (w / v) </td></tr><tr><td> מעכבי פרוטאז השלם </td><td> 1x </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>Sonication חיץ</strong> </td></tr><tr><td> טריס-HCl, pH 8.0 </td><td> 25mm </td></tr><tr><td> EDTA-NaOH, ה-pH 8.0 </td><td> 5mm </td></tr><tr><td> SDS </td><td> 0.5% (w / v) </td></tr><tr><td> מעכבי פרוטאז השלם </td><td> 1x </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>נוגדן מחייב חיץ</strong> </td></tr><tr><td> טריס-HCl, pH 8.0 </td><td> 50mm </td></tr><tr><td> EDTA-NaOH, ה-pH 8.0 </td><td> 1mm </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 150mm </td></tr><tr><td> טריטון X-100 </td><td> 0.1% (w / v) </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>מלח נמוכה לשטוף חיץ</strong> </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 150mm </td></tr><tr><td> SDS </td><td> 0.1% (w / v) </td></tr><tr><td> טריטון X-100 </td><td> 1% (w / v) </td></tr><tr><td> EDTA-NaOH, ה-pH 8.0 </td><td> 2mm </td></tr><tr><td> טריס-HCl, pH 8.0 </td><td> 20mm </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>מלח גבוהה לשטוף חיץ</strong> </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 500mm </td></tr><tr><td> SDS </td><td> 0.1% (w / v) </td></tr><tr><td> טריטון X-100 </td><td> 1% (w / v) </td></tr><tr><td> EDTA-NaOH, ה-pH 8.0 </td><td> 2mm </td></tr><tr><td> טריס-HCl, pH 8.0 </td><td> 20mm </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>LiCl לשטוף חיץ</strong> </td></tr><tr><td> ליתיום כלוריד </td><td> 250mm </td></tr><tr><td> Nonidet-P40 </td><td> 1% (V / V) </td></tr><tr><td> נתרן desoxycholate </td><td> 1% (w / v) </td></tr><tr><td> EDTA-NaOH, ה-pH 8.0 </td><td> 1mm </td></tr><tr><td> טריס-HCl, pH 8.0 </td><td> 20mm </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> <strong>TE לשטוף חיץ</strong> </td></tr><tr><td> EDTA-NaOH, ה-pH 8.0 </td><td> 10mm </td></tr><tr><td> טריס-HCl, pH 8.0 </td><td> 1mm </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> <strong>Decrosslinking חיץ</strong> </td></tr><tr><td> טריס-HCl, pH 6.8 </td><td> 62.5mM </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 200mm </td></tr><tr><td> SDS </td><td> 2% (w / v) </td></tr><tr><td> DTT </td><td> 10mm </td></tr></tbody></table><p class="jove_title" style=";text-align:right;direction:rtl"> 6. נציג התוצאות: </p><p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> הביטוי של הגן <em>ארבידופסיס thaliana PR2</em> הגנה קידוד β-1,3-glucanase עם פעילות מיקרוביאלית <sup>12,</sup> הנגרמת על ידי benzothiadiazole (BTH), אנלוגי סינתטי של חומצה סליצילית הורמון צמח <sup>3.</sup> <strong>איור 1</strong> מראה כי הפעלת הביטוי <em>PR2</em> קשורה לעלייה acetylation של שאריות ליזין על היסטון H3 ו-H4 על האמרגן <em>PR2.</em> מאז צפיפות הנוקלאוזום פוחתת במהלך הפעלת הגנים <sup>13,</sup> ערכים acetylation היסטון היו מנורמל עבור האות המתקבל עם נוגדן לאזור משתנה של היסטון 3. </p><p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"><img src="/files/ftp_upload/3096/3096fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"><br> <strong>איור 1 BTH גורם acetylation היסטון על האמרגן <em>PR2</em> ב ארבידופסיס.</strong> צמחים שטופלו 100μM BTH או פקד אבקת wettable. לאחר 72h, העלים נאספו הכרומטין היה מבודד. האות המתקבל לאחר משקעים עם נוגדנים ספציפיים acetylation (כמצוין באיור) היה מנורמל לאות מתקבל על ידי משקעים עם נוגדן ל תחום משתנה של היסטון H3. הכרומטין זירז היה לכמת על ידי RT-qPCR. הנתונים סטנדרטי עבור רמות שינוי היסטון בהעדר טיפול BTH. </p>

<ol><li>Eberharter, A., Becker, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+acetylation%3A+a+switch+between+repressive+and+permissive+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+rep%22%5BJournal%5D)">Histone acetylation: a switch between repressive and permissive chromatin.</a> <em>EMBO rep</em>. <strong>3</strong>, 224-229 (2002).</li>
<li>Ruthenburg, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylation+of+lysine+4+on+histone+H3%3A+intricacy+of+writing+and+reading+a+single+epigenetic%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Methylation of lysine 4 on histone H3: intricacy of writing and reading a single epigenetic.</a> <strong>25</strong>, 15-30 (2007).</li>
<li>Jaskiewicz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modification+acts+as+a+memory+for+systemic+acquired+resistance+in+the+plant+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+rep%22%5BJournal%5D)">Chromatin modification acts as a memory for systemic acquired resistance in the plant stress response.</a> <em>EMBO rep</em>. <strong>12</strong>, 50-55 (2011).</li>
<li>Ng, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ordered+histone+modifications+are+associated+with+transcriptional+poising+and+activation+of+the+phaseolin+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Ordered histone modifications are associated with transcriptional poising and activation of the phaseolin promoter.</a> <em>Plant Cell</em>. <strong>18</strong>, 119-132 (2006).</li>
<li>Offermann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illumination+is+necessary+and+sufficient+to+induce+histone+acetylation+independent+of+transcriptional+activity+at+the+C4-specific+phosphoenolpyruvate+carboxylase+promoter+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Illumination is necessary and sufficient to induce histone acetylation independent of transcriptional activity at the C4-specific phosphoenolpyruvate carboxylase promoter in maize.</a> <em>Plant Physiol</em>. <strong>141</strong>, 1078-1088 (2006).</li>
<li>Deng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+histone+acetyltransferase+AtHAC1+in+the+regulation+of+flowering+time+via+repression+of+FLOWERING+LOCUS+C+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Involvement of the histone acetyltransferase AtHAC1 in the regulation of flowering time via repression of FLOWERING LOCUS C in Arabidopsis.</a> <em>Plant Physiol</em>. <strong>143</strong>, 1660-1668 (2007).</li>
<li>Benhamed, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+GCN5%2C+HD1%2C+and+TAF1%2FHAF2+interact+to+regulate+histone+acetylation+required+for+light-responsive+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis GCN5, HD1, and TAF1/HAF2 interact to regulate histone acetylation required for light-responsive gene expression.</a> <em>Plant Cell</em>. <strong>18</strong>, 2893-2903 (2006).</li>
<li>Bowler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+techniques+for+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Chromatin techniques for plant cells.</a> <em>Plant Journal</em>. <strong>39</strong>, 776-789 (2004).</li>
<li>Orlando, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+chromosomal+proteins+in+vivo+by+formaldehyde+decrosslinked-chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Mapping chromosomal proteins in vivo by formaldehyde decrosslinked-chromatin immunoprecipitation.</a> <em>Trends Biochem. Sci</em>. <strong>25</strong>, 99-104 (2000).</li>
<li>Haring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation%3A+optimization%2C+quantitative+analysis+and+data+normalization%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Meth%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization.</a> <em>Plant Meth</em>. <strong>3</strong>, 11-11 (2007).</li>
<li>Danker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+information+but+not+promoter+activity+controls+the+methylation+state+of+histone+H3+lysine+4+on+two+photosynthetic+genes+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Developmental information but not promoter activity controls the methylation state of histone H3 lysine 4 on two photosynthetic genes in maize.</a> <em>Plant J</em>. <strong>53</strong>, 465-474 (2008).</li>
<li>Uknes, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquired+resistance+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Acquired resistance in Arabidopsis.</a> <em>Plant Cell</em>. <strong>4</strong>, 645-656 (1992).</li>
<li>Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome+displacement+in+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Develop%22%5BJournal%5D)">Nucleosome displacement in transcription.</a> <em>Genes Develop</em>. <strong>20</strong>, 2009-2017 (2006).</li>
</ol>

<p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> אין ניגודי אינטרסים הכריז. </p>

<p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול הם crosslinking של דנ&quot;א ההיסטונים, סוג וכמות החומר עלה, שחיקה של החומר, ואת sonication של הכרומטין. לדיון מפורט יותר של סוגיות אלה, ראה השופטים. 9 ו -10. </p><p class="jove_step" style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonication ו crosslinking: </p><p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> חשוב לשבש הכרומטין במהלך sonication כדי שברי על 400bp. Sonication ממצה יהרוס הכרומטין ע&quot;י שיבוש דנ&quot;א ההיסטונים, ואילו sonication מספיק יותיר שברים הכרומטין ארוך. אלו משפיעים על סגוליות של השיטה, כי שינויים היסטון דיסטלי של מוקד שנבדקו לא ניתן להפלות בין שינויים מקומיים. יעילות Sonication נבדק הטובה ביותר על ידי איסוף דגימות הכרומטין 20μL לפני ואחרי ה-DNA, דה crosslinking sonication ו ההיסטונים, בידוד דנ&quot;א בקביעת אורכו של ה-DNA טעון על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose. RNAse יש להוסיף את דגימות לפני אלקטרופורזה, משום הכנה הכרומטין עדיין מכיל כמויות גדולות של RNA בשלב הזה של טיהור שעשוי להפריע להדמיה של ה-DNA מקוטעת. הדגימות שימושיים immunoprecipitation הכרומטין אם דנ&quot;א הכרומטין אי טעון ארוך יותר 10kbp, בעוד ה-DNA של הכרומטין טעון צורות כתם עם עוצמת אות מקסימלית סביב 400bp של ה-DNA. </p><p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו משתמשים באופן שגרתי 3% (v / v) פורמלדהיד עבור crosslinking הכרומטין בעלים שלמים, אבל 1% (v / v) פורמלדהיד עשוי להיות מספיק ברוב המקרים. בידיים שלנו, פורמלדהיד בריכוזים נמוכים מאפשרים פעמים sonication קצר אותות רקע עקב התגובות PCR. עם זאת, כמויות מספיקות של פורמלדהיד לעיתים לגרום reproducibility נמוך של האות PCR בין ניסויים עצמאיים. זה יכול להיות בגלל חדירה מספקת של עלים עם פורמלדהיד בריכוזים נמוכים. הקפד בורסה פורמלדהיד שלך בתדירות גבוהה ככל במתחם נוטה לפלמר עם הזמן. פורמלדהיד פתרונות יציבים רק למשך חודש אחד בערך, וגם זה בקושי תקופה ממושכת על ידי ייצוב מתנול. מומלץ לבדוק את ריכוזי פורמלדהיד שונים בעת הגדרת תנאי הניסוי. </p><p class="jove_step" style=";text-align:right;direction:rtl"> כמות של חומר צמחי וטחינה: </p><p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> חשוב לחדור כמויות נמוכות של החומר עלה בנפח גדול של חיץ כדי למנוע עלים דבוקים זה לזה. ליף דבק לעתים קרובות תוצאות חדירה מספקת של פורמלדהיד. יתר על כן, חומר צמחי רב מדי יחסום נקבוביות של הרקמה miracloth. יעילות שחיקה ניכרת תלוי בעזרת מכתש ועלי עם התאמה מושלמת. אנו שגרתי לטחון עם העלי חנקן נוזלי מקורר ו מרגמה בהעדר חנקן נוזלי נוספות שלוש פעמים במשך 50 שניות עד החומר הקרקע לאבקה דקה. </p>

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> חלבון-A-agarose </td><td> רוש </td><td> 11 134 515 001 </td><td> תלוי בכיתה נוגדן </td></tr><tr><td> חלבון ה-G-agarose </td><td> רוש </td><td> 11 243 233 001 </td><td> תלוי בכיתה נוגדן </td></tr><tr><td> Anti-hyperacetyl-H4 </td><td> Millipore </td><td> 06-946 </td><td> השתמשנו 5μL </td></tr><tr><td> Anti-אצטיל-H4K5 </td><td> Millipore </td><td> 07-327 </td><td> השתמשנו 5μL </td></tr><tr><td> Anti-אצטיל-H4K8 </td><td> Millipore </td><td> 07-328 </td><td> השתמשנו 5μL </td></tr><tr><td> Anti-אצטיל-H4K12 </td><td> Millipore </td><td> 07-595 </td><td> השתמשנו 5μL </td></tr><tr><td> Anti-אצטיל-H4K16 </td><td> Millipore </td><td> 07-329 </td><td> השתמשנו 5μL </td></tr><tr><td> Anti-אצטיל-H4K18 </td><td> Millipore </td><td> 07-354 </td><td> השתמשנו 1μL </td></tr><tr><td> Anti-אצטיל-H3K9 </td><td> Millipore </td><td> 07-352 </td><td> השתמשנו 5μL </td></tr><tr><td> Anti-אצטיל-H3K14 </td><td> Millipore </td><td> 07-353 </td><td> השתמשנו 1μL </td></tr><tr><td> Anti-trimethyl-H3K4 </td><td> Diagenode </td><td> PAB-003-50 </td><td> השתמשנו 5μL </td></tr><tr><td> Anti-דימתיל-H3K4 </td><td> Millipore </td><td> 07-030 </td><td> השתמשנו 5μL </td></tr><tr><td> Anti-monomethyl-H3K4 </td><td> Abcam </td><td> ab8895 </td><td> 2,5-10μL </td></tr><tr><td> Anti-H3 </td><td> Abcam </td><td> ab1791 </td><td> השתמשנו 1μL כדי לבדוק צפיפות היסטון </td></tr><tr><td> Bioruptor </td><td> Diagenode </td><td> UCD TO-200 </td><td></td></tr><tr><td> Sonotrode MS72 </td><td> Bandelin </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Miracloth </td><td> Calbiochem </td><td> 475855 </td><td></td></tr><tr><td> מעכבי פרוטאז השלם </td><td> רוש </td><td> 11836145001 </td><td></td></tr></tbody></table>

זיהוי של שינויים היסטון בעלים הצמח

Detection of Histone Modifications in Plant Leaves

<p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> מבנה הכרומטין חשוב בוויסות של ביטוי גנים אאוקריוטים. בתהליך זה, שיפוץ הכרומטין, מתילציה DNA, שינויים קוולנטיים על אמינו מסוף הזנבות של ההיסטונים H3 ו-H4 ממלאים תפקידים חיוניים <sup>1-2.</sup> H3 ו-H4 שינויים היסטון כוללים מתילציה של ליזין ארגינין, acetylation של ליזין, ו זרחון של שיירי סרין <sup>1-2.</sup> שינויים אלו קשורים גם עם הפעלת הגן, דיכוי, או מדינה ערוכה של הגן התומכת הפעלה מהירה יותר וחזקה הביטוי אחרי תפיסה של אותות המתאים (חיידק הקשורים דפוסי מולקולרית, אור, הורמונים וכו &#39;), <sup>3-7.</sup> </p><p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> כאן, אנו מציגים שיטה לגילוי אמין ורגיש של שינויים הכרומטין גנים ספציפיים על הצמח הנבחר. הטכניקה מבוססת על crosslinking של (שינה) היסטונים ו-DNA עם <sup>8,9</sup> פורמלדהיד, מיצוי sonication של הכרומטין, הכרומטין immunoprecipitation (שבב) עם נוגדנים ספציפיים שינוי <sup>9,10,</sup> דה crosslinking-DNA של היסטון קומפלקסים, ו גנים ספציפיים בזמן אמת PCR כמותי. הגישה הוכיחה שימושי לאיתור שינויים היסטון ספציפיות הקשורות הפוטוסינתזה C <sub>4</sub> ב <sup>5,11</sup> תירס חסינות מערכתי <sup>3</sup> ארבידופסיס. </p>

<p class="jove_content">גישה אמין ושימושי כדי לזהות שינויים היסטון על גנים ספציפיים צמח מתואר. הגישה משלבת הכרומטין immunoprecipitation (שבב) בזמן אמת PCR כמותי. היא מאפשרת זיהוי של שינויים היסטון על גנים ספציפיים עם תפקיד בתהליכים פיזיולוגיים שונים.</p>

מבנה הכרומטין חשוב עבור הבקרה של ביטוי גנים באיקריוטים. בתהליך זה, רה-מודלינג של כרומטין (chromatin remodeling), מתילציה של DNA ו... קוולנטיים

<p>השיטה הבאה מציעה זיהוי מהימן ורגיש של מודיפיקציות כרומטין ספציפיות בגנים נבחרים בצמחים. ראשית, בצעו קישור צולב (cross-link) של היסטונים שעברו מודיפיקציה ושל DNA באמצעות פורמאלדהיד. לאחר מכן, חלצו את הכרומטין ובצעו סוניקציה כדי להקל על ביצוע אימונו-השקיעה (immunoprecipitation) באמצעות נוגדים ספציפיים למודיפיקציה.</p><p>לבסוף, נתחו את תגובת ה-ChIP באמצעות קישור צולב (cross-linking) של קומפלקסים של היסטון-DNA ו-qPCR (PCR כמותי בזמן אמת) ספציפי לגנים. בצמחים, גישה זו יכולה לספק תובנות מולקולריות, כגון שינויים ספציפיים בהיסטונים הקשורים לפוטוסינתזה מסוג C4 בתירס ולחסינות סיסטמית ב-Arabidopsis. היתרון העיקרי של שיקוע חיסוני של כרומטין על פני שיטות קיימות, כגון ספקטרומטריית מסות, הוא שטכניקה זו מאפשרת זיהוי של שינויים בהיסטונים ברצפים נבחרים בגנום של הצמח.</p><p>בדרך כלל, אנשים שאינם מכירים את השיטה הזו יתקשו, מכיוון שהפרוטוקול כולל מספר שלבים שביצועם המדויק הוא המפתח להצלחת הפרוקודורה. בסרטון זה, אנו משתמשים בניתוח ChIP כדי לספק תובנה על הפרה של ביטוי גנים בצמח המודל Arabidopsis ANA. מי יאקוביץ', סטודנט לדוקטורט, ידגים את הפרוקודורה. עבור כל דגימה, התחילו בקציר של שני גרמים של עלי arabidopsis ובמבחנה פלסטית בנפח 50 מיליליטר. מלאו את המבחנה עד לסימון של 40 מיליליטר בתמיסת קישור (crosslinking buffer) והניחו ספוג סינון מותאם בדיוק מעל פני התמיסה כדי להבטיח שהעלים יישארו טבולים.</p><p>כעת, העבירו את הדגימות למייבש (desiccator) עם ואקום וסננו למשך 10 דקות. כדי לעצור את תגובת הצלב (crosslinking), הוסיפו 2.5 milliliters של גליצין בריכוז two molar וערבבו על ידי היפוך המבחנה. לאחר מכן, סננו שוב למשך חמש דקות, המשיכו בוואקום, וסננו למשך חמש דקות נוספות.</p><p>לאחר מכן, השליכו את הנוזל תוך써 איסוף העלים על גבי נפה. לאחר שטיפת העלים פעמיים עם ליטר אחד של מים בכלי בקרי פלסטיק, ייבשו את העלים ביסודיות בעזרת נייר סופג, אספו את העלים לשפופרת פלסטיק נקייה והקפיאו בחנקן נוזלי. אחסנו את הדגימות בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס עד לביצוע בידוד הכרומטין.</p><p>בעזרת מכתש ועלי שחוקים המקוררים בחנקן נוזלי, גרסו את הדגימות הקפואות לאבקה דקה. העבירו את האבקה למבחנה מפלסטיק בנפח 50 milliliter. השעו את האבקה ב-30 milliliters של תמיסת מיצוי (extraction buffer) מספר אחת, והדגירו למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 °C על מנער (shaker) עילי.</p><p>העבירו את התמיה דרך ארבעה שכבות של בד מראה לתוך נבובת פלסטיק נקייה בנפח 50 milliliter. לאחר סבב צנטריפוגה, השליכו את העל-נוזל (supernatant). לאחר מכן, השתמשו במכחול כדי לתלות מחדש את המשקע ב-50 microliters של באפר מיצוי מספר 2, ואז הוסיפו 950 microliters נוספים של באפר מיצוי.</p><p>שנית, העבירו את התסמין למבובת מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר וסבבו בצנטריפוגה למשך 10 דקות. במקביל, הכינו מבובות מיקרו-צנטריפוגה של שני מיליליטר המכילות 1.5 מיליליטר של בופר מיצוי. שלב מספר שלוש.</p><p>בשלב הבא, השליכו את תעלילי העל כדי להשעות בהדרגה את המשקע ב-300 microliters של חוצץ מיצוי. מספר שלוש. ראשית, הוסיפו נפח קטן של חוצץ.</p><p>שלישי, השביה את המשקע באמצעות מכחול ואז הוסף את שארית התמיcoprotein. כעת, שכבה בזהירות את הדגימות על גבי המבחנות שהוכנו עם 1.5 milliliters של תמירון מיצוי. שלישי, תוך הבטחה שהשני הפאזות לא יתערבבו, סבב את הדגימות במערך צנטריפוגה למשך שעה אחת ב-16,000 ×g בטמפרטורה של 4 °C.</p><p>שפכו את הנוזל העליון והשעו את משקע הכרומטין בעזרת מברשת צבע ב-300 µL של חוצץ סוניקציה. בצעו סוניקציה לכרומטין עד לגודל DNA של כ-400 base pairs. במהלך הסוניקציה, ודאו שהכרומטין לא יתחמם מעל ל-30 °C בקירוב. כדי להגן על קשרי הצלב הרגישים לחום, סובבו את דגימת הסוניקציה בצנטריפוגה כדי להשקיע חומרים לא מומסים, והעבירו את הנוזל העליון למבחנות מיקרו-צנטריפוגה של 2 mL המכילות אגרוז פרוטאין וחוצץ לקישור נוגדנים.</p><p>הוסיפו 200 µL מתמיסת הכרומטין שהוכנה מהדגימה. דגרו את המבחנות במשך שעה אחת על שייקר תלוי. לאחר הצנטריפוגציה, אספו את העלונות מהדגימות והעבירו למבחנות נפרדות (aliquot) של 30 µL חלבון.</p><p>העבירו לנבובות חדשות בנפח 1.5 מיליליטר לצורך קביעת ריכוז הכרומטין של חומר המוצא. שמרו 40 µL של הכרומטין שעבר סוניקציה. לאחר מכן, הוסיפו 400 µL של תרחיף הכרומטין שעבר סוניקציה ל-30 µL של תמיסת חלבונים ולכמות מתאימה של נוגדן ספציפי למודיפיקציה, והדגירו למשך לילה במנערה בטמפרטורה של 4 °C.</p><p>אספו את החרוזים על ידי צנטריפוגציה למשך שתי דקות ב-440 ×g. הסירו את הנוזל העליון ובצעו שטיפות עקיפות של משקעי החרוזים למשך 10 דקות עם 900 µL מהבופר המתאים על שייקר תלוי. לאחר השטיפה האחרונה, הסירו לחלוטין את כל שאריות הבופר. כדי לשחרר את ה-DNA מההיסטונים, הוסיפו לחרוזים 400 µL של בופר D cross linking ואת דגימת הקלט בנפח 40 µL שנשמרה קודם לכן; ערבבו בוורטקס למשך חמש דקות, צנטריפוגו את הדגימות והדריכו (incubate) בטמפרטורה של 65 °C למשך הלילה.</p><p>כעת, טהרו את ה-DNA באמצעות ערכה מסחרית לניקוי DNA ובצעו R-T-P-C-R כמותי בזמן אמת (real-time quantitative) ספציפי לאתר (locus specific) קונבנציונלי. בדוגמה זו, הביטוי של הגן ANA PR two של Arabidopsis, גן הגנה, הושרה על ידי Benzo Diaz ole, אנלוג סינתטי של ההורמון הצמחי salicylic acid. התוצאות מדגימות כי הפעלה של ביטוי PR two קשורה לעלייה באצטילציה של שארי שם lysine להיסטונים H3 ו-H4 בפרומוטר של PR two.</p><p>בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי הוספת תמיסות המיצוי הראשונה (extraction buffer one) לאבקת העלים גורמת ללחץ יתר בתוך מבחנת ה-fcon הסגורה. יש לזכור לפתוח את המבחנה מדי פעם. כמו כן, יש להקפיד לא להוציא את מכחול הצבע לאחר סספנסיית המשקעים ולפני הוספת התמיסה הבאה.</p><p>לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של האופן שבו ניתן לקבוע מודיפיקציות של היסטונים ולמפות את מיקומן, תוך שימוש בצליבה המבוססת על פורמאלדהיד של DNA והיסטונים, בידוד של שיקוע חיסוני של כרומטין (ChIP) וכמות DNA ספציפית לאטוס, כדי לענות על שאלות מפתח בנוגע לתפקיד הכרומטין והמודיפיקציות שלו בתחומים שונים של ביולוגיה של צמחים.</p>

detection-of-histone-modifications-in-plant-leaves

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מתארים כאן פרוטוקול לטיהור והאפיון של קומפלקסי חלבוני צמח. אנו מראים כי על ידי immunoprecipitating חלבון יחיד בתוך מתחם, כדי שנוכל לזהות לאחר translational השינויים שלה והשותפים באינטראקציה שלה.

זיהוי לאחר translational השינויים של קומפלקסי חלבוני צמח

אנו מספקים כאן פרוטוקול יעיל ואמין עבור immunostaining, הקרינה הכלאה באתר, מכתים DNA ואחרי הדמיה בביציות thaliana ארבידופסיס כל הר כמותיים, ברזולוציה גבוהה. שיטה זו השתמשה בהצלחה כדי לנתח שינויי הכרומטין ואדריכלות גרעינית.

שיטה יעילה לניתוח כמותי, תא בודד של הכרומטין שינוי ואדריכלות גרעינית בהר שלם-ביציות ב<em&gt; ארבידופסיס</em

immunoprecipitation הכרומטין הוא טכניקה רבת עוצמה לזיהוי DNA מחייבת אתרים של חלבוני ארבידופסיס in vivo. הליך זה כולל הכרומטין המקשר בין-ופיצול, immunoprecipitation עם נוגדנים נגד סלקטיבית החלבון של עניין, וניתוח qPCR של DNA הקשור. אנו מתארים assay שבב פשוט מותאם לצמחי ארבידופסיס.

הכרומטין immunoprecipitation Assay עבור זיהוי של אינטראקציות החלבון-דנ&quot;א ארבידופסיס<em&gt; In vivo</em

פרוטוקול זה מתאר עבודה משולבת במלואם לאפיון היסטון שלאחר translational שינויים באמצעות ספקטרומטריית מסה (MS). זרימת העבודה כוללת טיהור היסטון מן בתרביות תאים או רקמות, היסטון derivatization ועיכול, ניתוח MS באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית ננו זרימה והוראות לניתוח נתונים. הפרוטוקול מיועד להשלמה בתוך 2 - 3 ימים.

Workflow השלם עבור ניתוח שלאחר translational שינויים היסטון שימוש מלמטה למעלה ספקטרומטריית מסה: מתוך הפקת היסטון כדי ניתוח נתונים

הפרוטוקול פותח כדי לחלץ ביעילות היסטונים שלמים מחומרי עלה דורה ליצירת פרופיל של שינויים פוסט-תרגומיים של היסטון שיכולים לשמש כסמנים אפיגנטיים פוטנציאליים כדי לסייע בהנדסת יבולים עמידים לבצורת.

בידוד של היסטון מרקמת עלה דורה עבור פרופיל ספקטרומטריית מסה מלמעלה למטה של סמנים אפיגנטיים פוטנציאליים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לנתח את ההתפלגות הגנום של שינויים histone, אשר יכול לזהות גנים יעד חדשים בפתוגנזה של M. oryzae ופטריות חוטיות אחרות.

ניתוח כלל-גנומי של הפצת שינויים בהיסטון באמצעות שיטת רצף האימונו-הוצאה כרומטין <em>במגנפורטה אוריזה</em>

מחשוף תחת מטרות ותגיות (CUT&amp;Tag) היא אסטרטגיית פרופיל אפיגנומית כרומטין יעילה. פרוטוקול זה מציג אסטרטגיית CUT&amp;Tag מעודנת ליצירת פרופיל של שינויים בהיסטון בצמחים.

יצירת פרופיל של שינוי H3K4me3 בצמחים באמצעות מחשוף תחת מטרות ותגיות

פרוטוקול זה מתאר כיצד ניתן להשתמש במערכת תרביות תאים תלת-ממדית כדי למדל, לטפל ולנתח שינויי כרומטין במצב כמעט פיזיולוגי.

כימות ברמה הגלובלית של שינויים פוסט-תרגומיים של היסטון במודל תרבית תאים תלת-ממדית של רקמת כבד

העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית (FRET) היא טכניקת הדמיה לאיתור אינטראקציות של חלבונים בתאים חיים. כאן מוצג פרוטוקול FRET כדי לחקור את הקשר של אנזימים משני היסטון עם גורמי שעתוק המגייסים אותם למקדמי היעד לוויסות אפיגנטי של ביטוי גנים ברקמות צמחים.

חקירת אינטראקציות בין אנזימים המשנים היסטון לבין גורמי שעתוק <em>in vivo</em> על ידי העברת אנרגיה בתהודה פלואורסצנטית

תהליך עבודה אנליטי המבוסס על כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטריית ניידות יונים לכודים וספקטרומטריית מסה של זמן טיסה (LC-TIMS-ToF MS/MS) לביטחון גבוה וניתוח "מלמטה למעלה" בעל יכולת שחזור גבוהה של שינויים וזיהוי של היסטון בהתבסס על פרמטרים עיקריים (זמן שמירה [RT], חתך התנגשות [CCS] ויחס מסה למטען מדויק [m/z]).

בדיקת שינוי היסטון באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטריית ניידות יונים לכודים וספקטרומטריית מסה בזמן טיסה

פרוטוקול זה מתאר גישה בעלת תפוקה גבוהה להערכת דליפת יוני צמחים, פעילות פרוקסידאז וייצור קלוז באותה דגימה.

הערכת תגובות עלים למטבוליטים משניים מיקרוביאליים באמצעות פורמט בעל תפוקה גבוהה

למדו שיטת ChIP לזיהוי שינויים בהיסטונים בגנים ספציפיים בצמחים. הפרוטוקול משלב חציבה כרומטין ו-PCR כמותי בזמן אמת לחקירת מנגנוני ויסות גנים ב-Arabidopsis.

זיהוי של שינויים היסטון בעלים הצמח

גלה סרטונים נוספים