אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
אימונולוגיה
0 צפיות • 3:32 דק׳ • July 8th, 2025
קח צלחת מיקרובאר מצופה בשברי פיברונקטין רקומביננטיים והוסף תאי T חיוביים ל-CD8 עכבריים פעילים.
הציגו וקטורים רטרו-ויראלים המכילים RNA טרנסגני המקודד קולטן אנטיגן כימרי או CAR.
מכסים את הצלחת ואוטמים אותה בשקית כדי למנוע זיהום. צנטריפוגה של הצלחת במהירות נמוכה כדי להקל על אינטראקציה בין תא הנגיף.
פיברונקטין נקשר לנגיף ולתא, והופך אותם למיקומים כדי לשפר את העברת הגנים בתיווך הנגיף.
לאחר צנטריפוגה, הסר את השקית האטומה ודגר את הצלחת בתנאים פיזיולוגיים.
המעטפת של הווקטור הנגיפי מתמזגת עם קרום התא, ומשחררת את ה-RNA הנגיפי והאנזימים.
האנזימים הוויראליים מתעתקים לאחור את ה-RNA המשוחרר ומשלבים את ה-DNA המתקבל בגנום המארח, ומאפשרים לתאים לבטא CARs הקשורים לפני השטח.
ה-CAR כולל תחום קשירת אנטיגן ספציפי לאנטיגן המטרה ותחומי האיתות להפעלת תאי T.
תאי ה-CAR T הספציפיים לאנטיגן מוכנים לבדיקות במורד הזרם.
ביום הראשון, הכינו צלחות מצופות שברי פיברונקטין אנושי על ידי הוספת 0.5 מיליליטר פיברונקטין לבארות של צלחת בת 24 בארות ודגירה למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.
למחרת, הסר את תמיסת הפיברונקטין והוסף 1 מיליליטר של 2% BSA ב-PBS לבאר. דגרו את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, ושטפו את הבארות המטופלות עם 1 מיליליטר PBS סטרילי. הצלחת מוכנה לשימוש לאחר הסרת תמיסת הכביסה.
ספרו את תאי ה-CD8 T המופעלים באמצעות טריפאן כחול. אסוף אותם על ידי צנטריפוגה, והשהה אותם מחדש ב-5 מיליון תאים ברי קיימא למיליליטר לצורך התמרה. הוסף 100 מיקרוליטר של תרחיף תאי CD8 המופעל לכל באר של הצלחת המצופה פיברונקטין. לאחר מכן, הוסיפו 1.5 עד 2 מיליליטר מהמדיום המכיל נגיף שהוכן בעבר, וערבבו בתנועה מסתחררת כדי להוציא את התאים באופן שווה.
אוטמים את הצלחת בשקית רוכסן וצנטריפוגה בחום של 2000 פעמים גרם למשך 90 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס. הסר את הצלחת מהצנטריפוגה וקח אותה לארון בטיחות ביולוגי. הסר בזהירות את שקית הניילון וודא שהחלק החיצוני של הצלחת אינו מזוהם במדיום. העבירו את הצלחת לחממת פחמן דו חמצני של 37 מעלות צלזיוס.
לאחר 4 שעות, הסר 1 מיליליטר בינוני מכל באר. החלף אותו במיליליטר אחד של מדיום תאי T שלם שחומם מראש והחזיר את הצלחת לחממה.