טכניקת צימוד אבידין-ביוטין להצגת אנטיגנים ממוקדים על Mycobacterium bovis BCG

התחל בתרחיף של Mycobacterium bovis BCG, שטופל בחומר פעילי שטח לא יוני, כדי למנוע גוש חיידקים.

לאחר מכן, הוסף מגיב ביוטינילציה ודגירה.

מגיב ביוטינילציה זה, קומפלקס של ביוטין המורכב לקישור פונקציונלי, מקל על קשירת מולקולות ביוטין לחלבוני פני השטח של חיידקים, וסימון חיידקים.

לאחר הדגירה, צנטריפוגה את תרחיף החיידקים המסומן בביוטין להסרת מגיב ביוטינילציה שלא הגיב.

השעו מחדש את החיידקים במאגר. הוסף תמיסה של חלבון היתוך אבידין, חלבון רקומביננטי המורכב מתחום אנטיגן מטרה המאוחה לאבידין מונומרי.

במהלך הדגירה, אבידין נקשר לביוטין, מה שמקל על שינוי פני השטח של החיידקים עם אנטיגנים מטרה.

צנטריפוגה את התרחיף להסרת חלבוני היתוך לא קשורים.

השעו מחדש את החיידקים המצופים אנטיגן במאגר המכיל חומר פעילי שטח לא יוני. ציפוי האנטיגן על החיידקים יכול לשפר את תכונתו לעורר תגובות חיסוניות.

עבוד בארון בטיחות ביולוגית באמצעות ציוד מגן אישי מכיוון ש-BCG הוא פתוגן ברמה II.

כדי לביוטינילציה של פני השטח של תאי BCG, ראשית, גדלו את התאים על פלטפורמת שייקר לצפיפות המתאימה. אסוף כמיליארד תאים, ושטוף אותם שלוש פעמים באמצעות 500 מיקרוליטר PBST נטול אנדוטוקסין קר כקרח. לאחר מכן, סובב את התאים והשהה אותם ב-PBS סטרילי נטול אנדוטוקסין. לאחר מכן, הכינו ביוטין טרי של 10 מילי-מולרית Sulfo-NHS SS במים מסוננים סטריליים. לאחר מכן, דגרו חיידקים במיליליטר אחד של מרק המכיל 0.5 מילימולר של ביוטין Sulfo-NHS SS. בצע את הדגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.

לאחר מכן, שטפו את החיידקים המסומנים כעת שלוש פעמים עם 500 מיקרוליטר PBST קר כקרח, כדי להסיר את המגיב שלא הגיב. לאחר מכן, השעו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של PBST.

מערבבים 500 מיליון BCGs ביוטיניליים עם חלבון היתוך אבידין, לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם חלבון למיליליטר. תן לתגובה זו להימשך שעה בטמפרטורת החדר על שייקר. לאחר מכן, שטפו את החיידקים שלוש פעמים עם 500 מיקרוליטר PBST קר כקרח.