יצירת תאי CD8 T חיוביים בודדים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים

תרבית השרתה תאי גזע פלוריפוטנטיים על שכבת הזנה של תאי סטרומה על מטריצת ג'לטין.

שכבת ההזנה מחקה את הסביבה החוץ-תאית הטבעית, ומנחה את התמיינות תאי הגזע לאורגנואידים בצורת כיפה המכילים תאי אב המטופויאטיים.

הוסף אנזימים כדי לנתק את התאים שעברו תרבית משותפת.

העבירו את התאים לכלי מצופה ג'לטין טרי להדבקה של תאי סטרומל.

אסוף את תאי האב ההמטופויאטיים שאינם דבוקים במדיום התמיינות.

תרבו אותם על שכבת הזנה טרייה כדי לקדם התמיינות תאי אב לתאי T חיוביים כפולים עם קולטני CD4 ו-CD8 ותאי T שליליים כפולים חסרי שני קולטנים.

העבירו את התאים לצינור. דגרו עליהם עם חרוזים מגנטיים הנושאים נוגדנים ספציפיים ל-CD4 המתייגים באופן סלקטיבי את תאי ה-T החיוביים הכפולים.

השתמש במפריד מגנטי כדי לבודד את התאים החיוביים הכפולים ולתרבית אותם על שכבת הזנה טרייה.

תוסף עם תערובת ציטוקינים ונוגדנים כדי לעורר את התאים, לגרום לוויסות נמוך של קולטן CD4 ולקדם את ההתמיינות שלהם לתאים חיוביים בודדים CD8.

הכינו מנות OP9-delta-1 מג'לטין שבוע לפני התרבות המשותפת עם IPSCs אנושיים. הוסיפו 4 מיליליטר של 0.1% ג'לטין לשלוש מנות תרבית תאים חדשות, ודגרו אותן למשך 30 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה שואבים את הג'לטין ומוסיפים 8 מיליליטר של מדיה OP9 לכל מנה. מעבירים צלחת קונגלונט אחת של תאי OP9-delta-1 לשלושה כלים מצופים ג'לטין.

לאחר ארבעה ימים, הוסף 10 מיליליטר של מדיה OP9 לכל צלחת תאים בסך הכל 20 מיליליטר מדיה למנה. התחל בתרבית משותפת של IPSC אנושית על צלחות מפגש OP9-delta-1 שבעה עד שמונה ימים לאחר מעבר התאים. שאפו את המדיה מצלחת משולבת של IPSCs אנושיים, והוסיפו 10 מיליליטר של מדיה OP9.

חותכים ומנתקים מושבות תאים באמצעות כלי חד פעמי להעברת תאים, ומעבירים 350 עד 600 גושים של מושבות חתוכות על צלחת OP9-delta-1 עם 10 מיליליטר של מדיה OP9 טרייה. נדנדו את צלחת התרבות מצד לצד ומקדימה לאחור כדי להבטיח חלוקה אחידה של המושבות. למחרת, שאפו את המדיה המושקעת והחליפו אותה ב-20 מיליליטר של מדיה OP9 טרייה.

גושי ה-IPSC האנושיים שגודלו בתרבית משותפת על OP9-delta-1 למשך יום אחד צריכים להופיע כמושבות חד-שכבתיות קטנות ועגולות. ביום החמישי, שאפו 10 מיליליטר של מדיה משומשת והוסיפו 10 מיליליטר של מדיה OP9 טרייה. המושבות יתחילו להתמיין למזודרם פרימיטיבי, המאופיין במרכז כהה רב שכבתי.

חזור על תהליך זה ביום 9, ואז מבני המרכז הרב-שכבתי יתפתחו לצורות דמויות כיפה. קצרו את תאי האב ההמטופויאטיים ביום ה-13, ובשלב זה המבנים מורכבים מאורגנואיד מרכזי כהה המוקף ברשת של אזורים דמויי כיפה. שאפו את המדיה, ושטפו את התאים פעם אחת עם 5 מיליליטר של תמיסת המלח המאוזנת של האנק ללא פנול עם סידן ומגנזיום או HBSS.

לאחר הכביסה מוסיפים 250 מיקרוליטר של 5,000 יחידות למיליליטר קולגנאז-4 ל -10 מיליליטר HBSS. מוסיפים את התערובת לתאים ומדגרים אותם בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות. שאפו את תערובת הקולגנאז HBSS, ושטפו את התאים פעם אחת עם 5 מיליליטר PBS. לאחר שטיפה עם PBS, הוסיפו 5 מיליליטר של 0.25% טריפסין-EDTA, ודגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.

לאחר מכן, הוסף 4 מיליליטר של מדיה OP9, ושייך את שכבת התא על ידי פיפטינג ליצירת תרחיף חד-תאי. העבירו את מתלה התא לצינור חרוטי של 50 מיליליטר דרך מסננת של 100 מיקרומטר, וצנטריפוגה את הצינור ב-300 פעמים גרם ו-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. שאפו את הסופרנטנט, והשעו מחדש את התאים ב-10 מיליליטר של מדיה OP9.

צלחת את תרחיף התאים על צלחת תרבית תאים חדשה מג'לטין בגודל 10 סנטימטרים, ודגרה אותם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות. לאחר מכן, אסוף את כל התאים שאינם נדבקים על ידי פיפטינג עדין. העבירו את מתלה התאים לצינור חרוטי של 50 מיליליטר דרך מסננת, וצנטריפוגה כמתואר קודם לכן. לאחר מכן, שאפו את הסופרנטנט, והשעו מחדש את התאים ב-10 מיליליטר של אמצעי התמיינות.

צלחת את מתלה התא על צלחת משולבת חדשה OP9-delta-1. יש לעבור את התאים ביום ה-16 בהתאם להוראות כתב היד, ולהמשיך לעבור את התאים הלא נדבקים כל חמישה עד שבעה ימים לאחר מכן. לאחר 35 יום של התמיינות, העשירו את אוכלוסיית התאים החיוביים ל-CD4 על ידי בידוד חרוזים מגנטיים CD4 בהתאם לפרוטוקול היצרן.

לאחר מכן, השעו מחדש את התאים במדיה OP9 וצלחת 1 מיליליטר של תרחיף תאים לכל באר של תרבית רקמה שטוחה עם 24 בארות של OP9-delta-1. לעורר תאים על ידי הוספת 100 יחידות בינלאומיות של IL-2 אנושי, 5 ננוגרם של IL-7 אנושי, 500 ננוגרם של נוגדן CD3 אנטי אנושי ו-2 מיקרוגרם של נוגדן CD28 אנטי אנושי לכל באר. לאחר ארבעה עד שבעה ימים, ניתן לאסוף תאים לניתוח נוסף.