Microfabricated פוסט מערך גלאים (mPADs): גישה לבודד כוחות מכניים
1 באוקטובר 2007
בסרטון זה אנו מדגימים כיצד לפברק ולנצל microfabricated גלאי מערך פוסט (mPADs) כדי להעריך מודולציות של contractility הסלולר.
היי, אני נתן סניה דקי ואיתי היום ווס ליגן ורובי דסאי ומייק יאנג. ואנחנו מהמעבדה של כריס צ'ן כאן באוניברסיטת פנסילבניה. בסרטון זה נציג את הגישה שלנו למדידת כוחות משיכה תאיים באמצעות מערך מיקרו מפוברק של עמודים.
כוחות משיכה נוצרים באמצעות אינטראקציות מיוזין ואקטון וממלאים תפקיד חשוב בפיזיולוגיה שלנו. במהלך ההתפתחות, הם מאפשרים לתאים לנוע ממקום אחד למשנהו על מנת ליצור את המבנים המוקדמים של הרקמה שלנו. והם גם עוזרים בתהליך הריפוי מכיוון שהם נחוצים לסגירת פצעים או לנדידה וזחילה של לויקוציטים בגופנו.
אך למרבה הצער, אותם כוחות יכולים להזיק לבריאותנו במקרה של סרטן, גרורות או צמיחת כלי דם לעבר גידול. אז יש מעט מאוד שיטות שבהן אפשר למדוד את כוחות המשיכה הללו בצורה כמותית, ובמיוחד בקנה מידה מיקרו וננומטרי של תאים בודדים. רוב השיטות הנפוצות לחקר תאים במבחנה היו עם צלחות עם תחתית זכוכית או כלי פוליסטירן, אבל אלה מצעים קשיחים מאוד והם לא, הם לא מאפשרים לנו למדוד פיזית את כוחות המשיכה וההשמצות שהתא גורם.
ולכן היה קשה מאוד להבין את המנגנונים הבסיסיים של כוחות המשיכה ללא קריאה פיזיקלית כלשהי. וכך במעבדה של כריס צ'ן יש לנו טכניקה שמאפשרת לנו להתגבר על המגבלות הללו. השיטה שלנו מבוססת על מערך אנכי של שלוחות, שקנה המידה של קשיחותם וגודלם הם כאלה שתאים בודדים יתפשטו על פני מספר שלוחים ויסיטו אותם בתהליך.
המידות שבהן אנו משתמשים בתדירות הגבוהה ביותר הן קוטר של שלושה מיקרון, עמודים גליליים בקוטר, גובה 10 מיקרון עם מרכז של תשעה מיקרון למרווח מרכזי ומערך מלבני. עם זאת, ניתן לגוון את הממדים הללו כדי להתאים למגוון מחקרים סלולריים. אנו מתחילים עם מאסטר סיליקון קשיח שתוכלו לראות כאן ואז מתרגמים אותם לשלוחות-PDMS גמישות שאנו רואים כאן.
באמצעות טכניקה זו אנו יכולים למדוד את הסטיות של שלוחים בודדים תחת מיקרוסקופ ולגבות את כוחות המתיחה התאיים בעוצמה ובכיוון הנדרשים ליצירת סטיות כאלה. הפכנו את המצעים הללו לרפידות M לגלאי מיקרו פוסט מערך ובסרטון זה נראה לכם כיצד לייצר את רפידות M, החל ממאסטר הסיליקון דרך שכפול ה-PDMS, ולבסוף לחישוב אפנון והתכווצות סלולרית. היי, הנה אנחנו בחדר הנקי של המעבדות שלנו.
זהו חדר נטול אבק ורגיש לאור המאפשר לנו להפוך את ה- SU לשמונה עמודים שישמשו כמאסטר הסיליקון. נתחיל תחילה עם פרוסת סיליקון ועם זה נצפה אותה ב-SU שמונה התנגדות לצילום, SU 8 היא התנגדות שלילית והיא רגישה לאור. אז כאשר אנו מאירים אור דרך מסכת הצילום הזו, זה יגרום לאור לעצב את עמודי המיקרו ואז ליצור מבנה תלת מימדי, שיהיה אז שמונת העמודים SU שלאחר מכן יצוק ב-PDMS.
אז אחרי שסיימנו את כל העיבוד שלנו, הפרוסה תיראה כך, וזה המקום שבו יש לנו את עמוד המיקרו, מבני המיקרו פוסט שכבר יוצרו לתוך הוופל. אז כדי להפוך את המאסטרים, אנחנו מתחילים קודם כל עם פרוסת סיליקון חשופה וזה נוקה בטיפול באוזון במשך שבע דקות וגם ייבשנו את הוופל הזה למשך 30 דקות ב-120 מעלות צלזיוס. אנחנו הולכים לסובב את SU 8 2002 על זה כדי ליצור שכבת בסיס דקה מאוד לעמודים.
אז בגלל שאנחנו הולכים לסובב את SU 8, אני הולך ללבוש מסיכת גז, לטעון מחדש את הפרוסה לתוך המחזיק הזה כאן, לנקות את האבק מכל אבק שעשוי להיות שם, להניח אותו על הספינר, אנחנו הולכים לבדוק כדי לוודא שהוא ממורכז ואז נמשיך לשפוך את ה-SU 8 2002 על גבי זה. ואז נמשיך לסובב את הוופל. לאחר מכן אנו מניחים אותם על הפלטה החמה, האפייה הרכה.
אנחנו עושים את זה במשך דקה אחת לאחר מכן. לאחר מכן אנו לוקחים אותו ומעבירים אותו לפלטה החמה של 95 מעלות. ואנחנו עושים את זה במשך שתי דקות.
וכשזה יסתיים, ניקח את זה עכשיו ונלך לעשות את החשיפה להצפה ביישור המסכה. אוקיי, אז בדיוק סובבנו את SU 8, השכבה הראשונה של SU 8 על הוופל הזה, ועכשיו אנחנו צריכים לחשוף את כל הפרוסה כדי ליצור את שכבת הבסיס הראשונה עבור המיקרו עמודים. אז אנחנו צריכים לתת לזה 70 מיליג'אול של חשיפה.
אז אנחנו צריכים למדוד את עוצמת האור בפועל ביישור המסכה שלנו כאן. אז אנו מעמיסים את המונה לתוך המשקל ליישור המסכה. לאחר מכן אנו חושפים אותו באור.
זהו אור UV כאן. אנו מעמיסים את פרוסת הסיליקון על קשת היישור של המסכה, מניחים אותה בתוך קשת היישור של המסכה. והפעם אין לנו מסכה, כך שנוכל לחשוף את הסרט כולו.
בואו נשים את התריס ובואו נמשיך ונגדיל דקה אחת של חשיפה ואנחנו הולכים לחשוף. אז אחרי דקה אחת המערכת מוכנה, אנחנו יכולים להוציא את הוופל. ועכשיו אנחנו צריכים לעשות את האפייה שלאחר החשיפה.
אז זה עתה חשפנו את הוופל הזה ועכשיו נוסיף חום כדי לגרום לתגובת הצלבה לציפוי הראשון הזה של SU 8. אז אנחנו מניחים אותו על פלטה חמה של 65 מעלות למשך דקה אחת ואז אנחנו מעבירים לפלטה חמה של 95 מעלות למשך שתי דקות. לאחר תהליך של שתי דקות, אנו מכבים את הפלטה החמה ומאפשרים לוופל להתקרר בחזרה לטמפרטורת החדר, מה שלוקח כ -30 דקות.
אז סובבנו את השכבה השנייה שלנו של SU 8 על הוופל הזה. ועכשיו אנחנו צריכים לחשוף את זה דרך מסכת הצילום. הפעם נשתמש במסנן UV כדי לחסום את אור ה-UV העמוק הזה.
זוהי זכוכית אופטית של הויה שתוכלו להשיג, אך הפעם עלינו למדוד שוב את העוצמה. אז אנחנו הולכים להשתמש במד האור שלנו או שאנחנו הולכים להשתמש במסנן למעלה כדי למדוד את העוצמה שסוננה החוצה. ואז אנחנו הולכים להעמיס את המסכה לתוך קשת היישור של המסכה.
מתג זה יוצר ואקום המחזיק את המסכה במקומה. לאחר מכן נניח אותו בתוך קשתיות היישור של המסכה. לאחר מכן נניח את המסנן למעלה ואז נטען את הוופל שלנו.
אנחנו רוצים לוודא שיש מגע טוב, אז אנחנו מרימים אותו למגע ואז נתחיל את החשיפה לאחר החשיפה, נוציא את הוופל שלנו מיישור המסכה. אז עכשיו יש לנו אזורים שנחשפו באופן סלקטיבי. ניקח את זה לתנור, לצלחות החמות כדי לעשות עליו את האפייה שלאחר החשיפה.
אז בדיוק עשינו את הפו, האפייה האחרונה לאחר החשיפה, ועכשיו אנחנו הולכים לפתח את הוופל הזה כדי שנוכל לקבל את המבנים התלת-ממדיים. מה שאנחנו הולכים לעשות זה לשטוף את זה, לפתח את זה ב-P-G-M-E-A, שישטוף את ה-SU 8 הלא חשוף. אז אנחנו מתחילים תחילה במנה אחת של P-G-M-E-A ואנחנו יושבים כאן את הוופל במשך שתי דקות בהתרגשות קלה.
אז אני הולך להניח לזה לשתי דקות. אז אנחנו הולכים לעבור למנה שנייה של P-G-M-E-A. זה יסיר את ה-P-G-M-E-A הרווי עם SU 8.
לאחר 10 שניות נכניס אותו ל-IPA. זה שוטף את ה-P-G-M-E-A. הכנסנו אותו לכאן למשך 20 שניות, שוב עם תסיסה קלה.
ואז כרגע יש לנו את מבני העמודים העצמאיים. אז אנחנו הולכים להכניס את זה להקסאן, שיש לו מתח פנים נמוך. אנחנו הולכים לכבס במשך חמש שניות באחד ואז שני הקסנים, ואז אנחנו מוכנים לייבש אותו במייבש שיער.
אז בדיוק פיתחנו את הוופל ועכשיו אנחנו הולכים להניח אותו על פלטה חמה ולאט לאט להגביר את הטמפרטורה ל-50. ומה שקורה הוא שהטמפרטורה הגבוהה הזו מקשרת עוד יותר את ה-SU 8 כדי להפוך אותו לקשיח יותר מבחינה מבנית ואנחנו משאירים אותו על הפלטה החמה הזו למשך הלילה. אז בכל מקום בין 14 ל -20 שעות ולאחר מכן נכבה את הפלטה החמה ונאפשר לה להתקרר שוב לטמפרטורת החדר.
אז מה שאנחנו צריכים לעשות זה לחתוך את הוופל הזה לקוביות לגודל קטן יותר. אנחנו בעצם רוצים לחתוך את פרוסת הסיליקון הזו וליצור כאן שבב קטן של התבנית הפנימית הזו בלבד. וזה הולך להיראות כמו המבנה הזה שם שבו הם הולכים להשתמש באפוקסי.
ואנחנו הולכים להדביק את השבב הזה על מגלשת זכוכית ככה. וזה מספק גיבוי מבני. אז לחתוך רקיק, זה סוג של אומנות, אבל מה שאתה יכול לעשות זה בעצם להשתמש בסופר יהלומים ואתה מתחיל רק בקצה אחד.
ובגלל מישורי הקריסטל, אתה פשוט שם חריץ קטן עכשיו שיצר שבר, ואז אני יכול להקיש עליו עם הכלי הזה, אנחנו יכולים לקלף את זה ואז אנחנו יכולים לעשות כאן חיתוכים נוספים עד שנקבל מבנה קטן כזה. ואז אתה מניח במהירות את שבב הסיליקון עכשיו על הזכוכית ומרכיב אותו למקומו. ואתה נותן לזה להתייצב.
וכך אחרי שתסיים, יהיה לך מכשיר דומה לזה. אז הרכבנו את מאסטר הסיליקון על מגלשת הזכוכית הזו ועכשיו אנחנו הולכים לתת לו ציפוי של פלוף, שיעזור לשחרר את המבנה הזה מ-PDMS בהמשך. אז אנחנו הולכים למקם את השבב לתוך חומר הייבוש הזה ואז ניקח כמה טיפות של המקום הטרי כלורו סילינג הזה כמה טיפות לתוך הייבוש.
אנחנו עושים את זה בתוך מכסה המנוע כי זהו, יש לזה תוצר לוואי של גז הידרו-הידרוכלורי, שהוא די קשה. קדימה, סגור את המכסה, חבר את זה לוואקום ואז אנחנו ממשיכים ונותנים לזה לשבת מהוואקום ואנחנו נותנים להפקדה הזו למשך הלילה כדי לקבל ציפוי יפה על כל פרוסת הסיליקון. היי, אני ווסלי ליגן.
אני סטודנט לתואר שני במעבדה של כריסטופר צ'ן. בשלב זה, נייט הראה לך כיצד ליצור מאסטר סיליקון עבור מצעי ה-ED שלנו. עם זאת, לפני שנוכל להשתמש בכלי זה כדי למדוד התכווצות תאית יש צורך לשכפל תחילה את מבני הצילום הקשיחים באמצעות פולימר סיליקון אלסטומרי.
המשימה הראשונה שלנו היא ליצור תבנית שלילית של מאסטר הסיליקון שייצרנו קודם לכן. אנו עושים זאת באמצעות אלסטומר סיליקון שנקרא PDMS או פולימתיל סלואן לפולימר ה-PDMS שלנו. כעת אנו מוסיפים יחס של 1 ל-10 של חומר ריפוי.
לאחר ששקלנו את התמיסה, יש צורך לערבב היטב את פולימר ה-PDMS ואת החומר הדולף הצולב. הערבוב הזה כמובן מכניס הרבה בועות אוויר לתמיסה שלנו. אז בשלב זה, יש צורך לכסות אותו ולהוציא אותו מייבוש הוואקום.
ברגע שה-PDMS מנוקה לחלוטין וכל הבועות עלו לפני השטח והתפוצצו, נוכל להסיר אותו מייבשי הוואקום. כעת אנו יכולים להשתמש בתערובת זו של PDMS וחומר צולב כדי ליצור תבנית שלילית של מאסטר הסיליקון שלנו. וכדי לעשות זאת, אנו משתמשים בפח פאי ומניחים את מאסטר הסיליקון המותקן שלנו במרכזו.
לאחר מכן אנו שופכים בזהירות את תמיסת הפולימר DGAs לתוך הצלחת מעל החלק העליון של פרוסת הסיליקון בניסיון למנוע היווצרות בועות נוספות. בדרך כלל אנו מנסים לשפוך את הפולימר בעובי של כרבע סנטימטר. אתה יכול לראות שתהליך זה מכניס בהכרח כמה בועות אוויר לתערובת.
אז עכשיו הנחנו את המנה הזו בצד למשך כ -30 דקות כדי לאפשר לבועות לעלות אל פני השטח ולצוץ. אנו יכולים לראות שאחרי שנתנו לו לשבת, עדיין יש כמה בועות אוויר על פני השטח של ה-PDMS. אולם מאחר שאלה נמצאים על פני השטח העליונים, אנו יכולים כעת להשתמש בפרץ מהיר של חנקן כדי לפוצץ את כל הבועות שנותרו.
על מנת להצליב באופן מלא את תמיסת ה-PDMS וה-CROSSLINKER וליצור תבנית שלילית קשיחה של מאסטר הסיליקון שלנו, אנו אופים אותה ב-110 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. אנו יכולים לראות שיש שכבה דקה של PDMS על גבי מצע הסיליקון. ולפני שנוכל לקלף את השניים, יש צורך לחתוך תחילה את השכבה הזו.
לאחר מכן נוכל להשתיל את השכבה העליונה הזו ולקלף אותה בעדינות ממצע הסיליקון. בשלב זה, אנו יכולים להפוך ולקלף לאט מאוד את מצע הסיליקון השלילי, מצע ה-PDMS השלילי הרחק ממאסטר הסיליקון. אוקיי, אנו עושים זאת על ידי החזקת קצה אחד כלפי מטה וקילוף עדין של מצע ה-PDMS.
אתה יכול לראות את ההתקדמות הקדמית כשהמצע מתקלף ממאסטר הסיליקון. כעת, לאחר שיצרנו תבנית שלילית A-P-D-M-S של מאסטר הסיליקון שלנו, אנו יכולים לחתוך אותה לארבע תבניות שליליות בודדות כדי ליצור את מצעי הרפידה הסופיים. חשוב בשלב זה לא לגעת בחלק העליון של המצע השלילי עם מלקחיים או כפפות כדי למנוע פגיעה במשטח.
אז בשלב זה, יצרנו ארבע תבניות שליליות בודדות ממאסטר הסיליקון המורכבות משלוש בארות בקוטר מיקרון, בעומק תשעה מיקרון. על מנת לחדש את משטחי השלוחה המוגבהים, אנו יכולים ליצוק שוב על תבניות שליליות אלה מ-PDMS PDI תוך שימוש ב-PDMS. עם זאת, לפני שנעשה זאת, יש צורך תחילה להפוך את התבניות השליליות הללו ללא דביקות על ידי ציפוי בפלואורוס.
אנו עושים זאת בתא פלזמה של מאה וואט בעוצמה מלאה למשך דקה אחת. לאחר שמאפשר לתא לשאוב חזרה על הפלזמה, זה יוצר שדה גז יונים החורט את המשטח העליון של ה-PDMS והופך אותו לדביק יותר למולקולות הפלואורו סי ליין. לאחר הסרת התבניות השליליות מייבוש הוואקום, תוכלו לראות כאן מה שנותר לנו הוא מערך של בארות בעומק של שלושה מיקרון על 10 מיקרון בשכבת PDMS לא דביקה.
על מנת לחדש את השלוחים האנכיים, בהם אנו משתמשים עבור מצעי ה-mpad, יש צורך לזרוק אותם שוב באמצעות אותה תערובת PDMS שלנו וזה ישאיר אותנו עם מערך עצמאי חיובי של שלוחות, המשקפות באופן זהה את מאסטר הסיליקון שייצרנו קודם לכן. השלב הראשון בהליך זה הוא להעביר את התבניות השליליות הלא דביקות שלנו על ג'יג הרכבה שיצרנו מרצועות PDMS ושקופית מיקרוסקופ זכוכית. הסיבה לאסדה זו תתברר בשלב הבא.
בשלב זה, אנו יכולים להפקיד טיפה קטנה מאותה תערובת של 10 ל-1 של PDMS ל-crosslinker שכבר דגה על המשטח העליון של כל אחת מהתבניות השליליות שלנו. יש צורך רק בכמות קטנה של PDMS כדי שלא תעבור על קצה התבניות השליליות. בשלב זה.
על מנת לפזר את ה-PDMS בצורה מלאה יותר על פני המשטח העליון של התבניות, אנו יכולים לתפוס אחד באמצעות מלקחיים, להפוך אותו ולהביא אותו למגע עם התבנית הסמוכה המתפשטת בזהירות סביב ה-PDMS כדי לכסות את כל המצע במלואו. היזהר מאוד בשלב זה לא להכניס בועות נוספות לפתרון ה- PDMS העליון יכול לחזור על עצמו עם שתי הבארות האחרות, שתי התבניות האחרות. כעת, כשיש לנו ציפוי PDMS אחיד יותר על פני המשטח העליון, אנו יכולים למקם את הג'יג הזה לתוך ייבוש ואקום כדי להסיר עוד יותר את כל הבועות שעלולות להילכד בסרט ה-PDMS על גבי התבניות השליליות שלנו.
תהליך זה אורך בדרך כלל כ-30 דקות. בעוד שהתבניות השליליות שלנו מתרוקנות, אנו יכולים לנקות את מצעי הזכוכית בגודל 22 על 22 מילימטר, שיהפכו למקום ההרכבה הסופי של הרפידות. השלב הראשון בתהליך זה הוא לפוצץ את כל חלקיקי האבק באמצעות חנקן דחוס.
נחשוף את החלקות כיסוי הזכוכית לפלזמת גז, שתאפר את פני השטח ותהפוך אותו לדביק יותר ל-PMS, אותו נדבק בשלב הבא. לאחר שאפשרנו לשכבה העליונה של PDMS ל-DGAs למשך כ-30 דקות ופלזמה המפעילה את החלקות כיסוי הזכוכית, נוכל להסיר את התבנית שלנו ולהביא את המשטח העליון של החלקות כיסוי הזכוכית, שנחשף לפלזמת הגז למגע עם שכבת ה-PDMS על גבי התבניות השליליות. בדרך כלל זה עוזר להביא קצה אחד של כיסוי הזכוכית למגע תחילה עם ה-PDMS ולאחר מכן לאפשר לשאר החלקת כיסוי הזכוכית להתיישב ב-SH כך שה-PDMS יתפשט בצורה דמוית גיליון.
זה עוזר להפחית את כל הבועות המוכנסות לסרט ה-PDMS. בשלב זה, אנו יכולים ללחוץ בעדינות על המשטח העליון של החלקת מכסה הזכוכית עם המלקחיים שלנו כדי לדחוף החוצה את כל ה-PDMS העודף וכן לדחוף את החלקת הכיסוי כלפי מעלה כנגד צלב ה-PDMS במרכז התבנית. זה ימנע מהחלקת הכיסוי להסתובב בזמן שה-PDMS מתרפא.
אנו חוזרים על כך עבור המצעים האחרים. בשלב זה נוכל להעביר את כל התבנית לתנור ולאפות בחום של 110 מעלות צלזיוס למשך 22 שעות. לאחר שאפשרנו לכל המכלול להתקרר לטמפרטורת החדר, נוכל להסיר את המצעים שלנו, להפוך אותם ולקלף בזהירות את התבנית השלילית מהחלקה של כיסוי הזכוכית.
חשוב לעשות זאת לאט ואחיד על מנת להימנע מריסוק העמודים או קריעתם ממצע הזכוכית. אנו יכולים לראות שלאחר קילוף התבנית השלילית, אנו נותרים עם מערך של שלוחות, שמחקה במדויק את מאסטר הסיליקון, רק שעכשיו הם בפנים, הם בנויים מאלסטומר PDMS גמיש. אוקיי, אז בנקודה זו הדרכנו אתכם כיצד אנו מייצרים את הסיליקון מאסטר של מצעי ה-Emad שלנו.
לאחר מכן, השתמשנו בתהליך יציקת העתק כדי ליצור העתק מדויק באמצעות פולימר אלסטומרי A-P-D-M-S כך שהשלוחים גמישים כעת כדי לאפשר לתא להתפשט ולהתכווץ ולהסיט את השלוחים בתהליך. בשלב זה, המצעים שלנו מוכנים לעיבוד לתרבית תאים. כעת, לאחר שראינו כיצד לייצר ולשכפל תבניות לייצור ה-eds, אנו הולכים לעשות עוד כמה שלבים על מנת להפוך את ה-EDS לפונקציונלי כך שנוכל לתרבת את עצמנו ולאחר מכן לנתח את כוחות המשיכה.
אבל לפני שנעשה זאת, עלינו לעשות שלושה דברים. אנחנו צריכים להפוך את קצות העמודים לדביקים לתאים. שנית, עלינו לתייג את ה-PDMS באופן פלואורסצנטי כדי לסייע בהדמיה וניתוח של סטיות פוסט.
ושלישית, עלינו להפוך את דפנות העמודים כמו גם את בסיס העמודים ללא דבק לתאים כך שכוחות המתיחה יופעלו רק בקצות העמודים. אז נראה כיצד השלבים הללו מתקדמים באמצעות אסטרטגיה מבוססת הדפסת מיקרו מגעים בדקות הבאות. אבל ראשית, השלב הבא הוא לנקות עודפי P-D-S-P-D-M-S מה-eds.
אז כמו שציינתי, הצעד הראשון הוא לקחת את מצע ה-EDS, שווסט הראה לך איך ליצור ולקצץ אותם. עודפי ה-PDMS שנבעו מריפוי מכסה הזכוכית מחליקים על התבנית השלילית ושימוש בגימור סכין גילוח חד. את עודפי ה-PDMS, אתה עושה זאת על ידי הנחת סכין הגילוח אנכית על המצע בקצה העמודים ואז גירוד.
ואתה יכול להשתמש באצבע אחת כדי להחזיק את החלקת הכיסוי במקומה כך שהחלקת הכיסוי לא תזוז. אז מה שאנחנו מקבלים בסופו של דבר הוא מצע M pad שנוקה מפסולת ולכן הוא נגיש בקלות. אז לשלב הבא, עלינו ליצור קשר מיקרו, להדפיס את ה-MPAs כדי להפוך את קצות העמודים לדביקים.
על מנת לעשות זאת, ראשית עלינו לייצר בולים, ותהליך זה קל מאוד. אנחנו פשוט מערבבים PDMS במקום יחס של 10 לאחד, יחס של אחד ל-30 לאחד. אנו שופכים פנימה צלחת פטרי כך שגובה ה- PDMS יהיה כסנטימטר אחד.
תן לזה להתפוגג. כלומר לתת לבועות לעלות לראש ה- PDMS ולרפא את תגובת הקישור הצולבת בתנור בחום של 60 מעלות למשך שעה לאחר הוצאת התבשיל מהתנור ולתת לו להתקרר, עכשיו אני מוכן לחתוך את החותמות. אז שוב, עם אותו סוג של סכין גילוח, פשוט חתוך על ידי לחיצה אנכית כלפי מטה לתוך ה-PDMS עד שאתה יוצר מגע עם תחתית צלחת הפטרי.
עכשיו כיוון החותמת הוא משהו שאנחנו רוצים לשים לב אליו. משטח הבול הולך להיות הצד של ה-PDMS שנוצק כנגד החלק התחתון של צלחת הפטרי כך שהוא יישאר שטוח. אז בריבוע הגדול הזה של PDMS שחתכתי, משטח הבול עכשיו פונה כלפי מעלה.
עכשיו החותמת הזו הרבה יותר גדולה מרפידות M, אז אני הולך לקצץ אותה שוב לגודל של פד M בודד על ידי חיתוך עם סכין הגילוח, מכיוון שקשה מאוד לדעת את הכיוון הנכון של החותמת בעין, אני הולך לשים חריץ קטן במה שיהיה הצד האחורי של החותמת שהוא הצד שאינו פנים בדיוק ככה. ואז אני יכול להסיר את החותמת מהלוח הגדול יותר. ועכשיו יש לי חותמת A-P-D-M-S לשלב הבא.
אנחנו רוצים לנקות את חותמות ה-PDMS. מכיוון שייתכן מאוד שאבק מהאטמוספירה התיישב על חותמות ה-PDMS בזמן שחתכתי אותן. זהו תהליך בו אנו מכניסים את המספר הרצוי של חותמות PDMS לתוך צלחת התגבשות זו וממלאים את צלחת ההתגבשות ב-100% אתנול.
אז פשוט הוסיפו מספיק אתנול כדי לכסות את פני הבולים, אבל הכמות המדויקת של אתנול שנוספה אינה חשובה. ואז הנח את דיסק ההתגבשות בטור ועשה סוניקציה של החותמות למשך חמש דקות. לאחר תום חמש הדקות, נסיים לעקר את החותמות ונעשה את שארית הדפסת המיקרו-מגע שהיא פונקציונליזציה של רפידות M במכסה מנוע סטרילי של תרבית רקמות.
אז עכשיו אנחנו במכסה המנוע של תרבית הרקמה שבו אנחנו יכולים לסיים לעקר את הבולים. לשם כך אנו לוקחים את החותמות מכלי ההתגבשות, טובלים אותם בכלי מלא באתנול כדי לשטוף את כל הפסולת שנותרה, ולבסוף טובלים אותם בכלי מים כדי לשטוף את האתנול. לאחר מכן, בעזרת זרם חנקן, אנו מייבשים את הבולים עד שלא נותרו עוד טיפות נראות לעין.
אז בשלב הבא, עלינו להדפיס את החותמות בתמיסת חלבון. תמיסת החלבון שאנו משתמשים בה היא 50 מיקרוגרם למיל פיברין במי DEI. כל שעליך לעשות הוא לקחת חלק מתמיסת החלבון בפיפטה ולהניח טיפות מתמיסת החלבון על פני החותמת.
אתה רוצה לעשות זאת על ידי הנחת טיפות קטנות על קצה פני החותמת. ראשית, חזור על זה עבור כל הבולים שבהם תשתמש והייתי צריך לעשות זאת מראש. אז השלב הבא לאחר שהנחתם נקודות על הקצוות של כל החותמות הוא לחבר את הטיפות הללו ולמלא את תמיסת החלבון על פני הבול.
הסיבה שעשינו זאת היא כי תמיסת חלבון בטיפות וב-sos מתחת לטיפות והופכת את משטח החותמת להידרופילי, מה שמקל על הפצת חלבון המטריצה החוץ-תאית. אז שוב, חזור על זה עבור כל הבולים שבהם אתה משתמש עכשיו לאחר שפיזרנו את תמיסת החלבון על פני הבולים, השלב האחרון בדיו של הבולים הוא לוודא שהקצוות מכוסים. לשם כך, אנו פשוט מכוונים פיפטה בזווית ומעבירים אותה לאורך פני החותמת כך שתיצור מגע הן עם פינת חותמת ה-PDMS והן עם תמיסת החלבון.
ושוב, חזור על פעולה זו עבור כל הקצוות של כל החותמות שאתה חותם בדיו. כעת, לאחר שסיימנו להטביע את החותמות, קבענו את החותמות, אנו משאירים את החותמות במכסה המנוע של תרבית הרקמה למשך שעה על מנת להקל על ספיגה מלאה של החלבון על פני הבול. אז עכשיו שחיכינו שעה עד שהחלבונים יגיעו למאגר שלהם, ייספגו על פני הבול, עכשיו הגיע הזמן לשטוף אותם במים ולייבש אותם בחנקן.
לשם כך אנו לוקחים מים סטריליים ושופכים את המים הסטריליים לכלי המכיל את החותמות. היזהר לא לשפוך את המים ישירות על פני הבול ותוכל להשתמש בפיפטה במידת הצורך. כמות המים המדויקת שהייתה לך אינה חשובה כל עוד אתה מביא את מפלס המים מעל תמיסת החלבון.
לאחר מכן, בעזרת פינצטה סטרילית, קחו חותמת אחת, טבלו אותה בכלי מים חדש ופוצצו אותה בעדינות עם חנקן. שוב, תדעו שהוא יבש כשאתם רואים, כשאתם כבר לא רואים טיפות של תמיסת חלבון על הבול. וחזור על כך עבור כל הבולים שאתה מעבד אחד בכל פעם.
אז עכשיו לאחר ששטפנו את החותמות יבשות, הגיע הזמן להפעיל את מצעי ה-mpad על ידי טיפול בהם באוזון UV. במשך שבע דקות אני מסיר את מכסה צלחת הפטרי מלמעלה, מהחלק העליון של המנה. מכיוון שאתה, מכיוון שפוליסטירן סופג UV, אני מכניס את המנה למטפל באוזון UV, סוגר את המגירה, מכוון את הזמן לשבע דקות ומשחרר אותו.
אז עכשיו חזרנו למכסה המנוע של תרבית הרקמה והגיע הזמן להחתים את מצעי ה-mpad, שזה עתה טופלו באוזון UV. לשם כך, הרם את החותמות השטופות והיבשות שלנו בעזרת מלקחיים. אתה יכול להתמודד עם החותמות בצדדים, אך אל תיגע בפנים של הבול.
אתה רוצה להתאים את החותמת במלקחיים כך שצד החלבון יהיה נגיש. לאחר מכן אתה הופך את המלקחיים, תוך התחשבות בכך שצד החלבון מבוסס כלפי מטה ולאט לאט מביא את החותמת למגע עם העורכים. הבולים מ-1 עד 30 הם די דביקים, כך שייתכן שתצטרך להשתמש בזוג פינצטה שני כדי לשחרר את החותמת מהמלקחיים.
אתה יכול להוריד את החותמת מגובה של כשני מילימטרים לכשמונה מילימטרים על ה-emeds. לאחר מכן הטה את צלחת ה-emeds כלפי מעלה ולחץ כלפי מטה בעדינות בעזרת מלקחיים על מנת ליצור מגע בין החותמת לעורכים. תדע מתי נוצר קשר באחת משתי דרכים.
הראשון הוא להסתכל על משטח ה-ED דרך הצד של החותמת. אולי קשה לראות זאת במצלמה, אבל בעין אני יכול לראות בבירור שהחותמת יוצרת מגע עם פני השטח על ידי התבוננות במשטח דרך צד הבול. הדרך השנייה להבטיח מגע היא עם ה-p, היא להוציא את צלחת הפטרי ממכסה המנוע של תרבית הרקמה עם המכסה ולצפות בה במיקרוסקופ הפוך.
על ידי הדמיית דפוסי הפרעה עם המיקרוסקופ, אתה אמור להיות מסוגל לדעת מתי, אם ומתי החותמת נמצאת במגע עם העורכים. לאחר שקבעת מגע, החותמת צריכה להישאר במגע עם זה בלבד, עם המצע האד למשך מספר שניות. אז עכשיו הגיע הזמן להסיר את החותמת.
לשם כך, קפלו את Eds כלפי מטה בעזרת פינצטה אחת ובתנועה חלקה אחת, קלפו את החותמת. הקפד לעקוב אחר אילו אדים החתמת ובאילו חותמות יש לך בעבר כבר השתמשת. וחזור על הליך זה פעם אחת לכל EMPAs עבור כל מצע שבו ברצונך להשתמש.
כעת, לאחר שאנו חותמים את ה-EMPAs, השלב הבא הוא לעקר אותם ואז לדגור אותם בצבע ליפופילי הנקרא עין צבע. דאי היא מולקולה ליפופילית המתויגת פלואורסצנטית, כך שהיא מתפזרת לתוך ה-PDMS במהלך הזמן המאפשר לנו לדמיין את הסטיות הפוסט-סטיות תחת המיקרוסקופ. אז מה שאני הולך לעשות זה לקחת כל מצע אמפה בודד אחד בכל פעם ולטבול אותו ב-100% אתנול, 70% אתנול DI מים DI מים DI מים.
ולבסוף, תמיסה של חמישה מיקרוגרם למיל של dii. תמיסת ה-DII היא פלואורסצנטית, כך שכדי למזער את חשיפתו לאור הסביבה ולמזער את הלבנת הצילום שלו, אנו מכסים את הכלים בנייר אלומיניום בזמן שהם דוגרים במכסה המנוע של תרבית הרקמה למשך שעה. כעת, לאחר שחיכינו שעה עד שרפידות ה- EM ידגרו בתמיסת ה- DAI, נוכל להסיר את נייר האלומיניום ולשטוף את תמיסת ה- DAI.
אנו שוטפים על ידי ביצוע שלוש טבילות עוקבות במים מעוקרים ולבסוף, אנו טובלים בתמיסה של 0.2% אוניק F1 27. זה 0.2% משקל לנפח במהלך כל שלבי הטבילה, חשוב למזער את הזמן שבו רפידות ה-EM נחשפות לאוויר. זאת כדי למנוע נזק למצעי ה-ED ובמיוחד למנוע משני עמודים לקרוס זה על זה.
0.2%onic F1 27 הוא קופולימר תלת-בלוק המורכב מתחומים הידרופיליים והידרופוביים. התחום ההידרופילי ידוע כעמיד בפני ספיגת חלבון ולכן הידבקות תאים בעוד שהתחום ההידרופובי נקשר למזג ל-PDMS ההידרופובי. לפיכך, כאשר PDMS ספוג ב-F1 27, ה-F1 27 נקשר ל-PDMS ודוחה הידבקות תאים.
לאחר שעה אחת של דגירה ב-F1 27 כרוני בצלחת פטרי מכוסה בנייר אלומיניום, אנו יכולים לשטוף את ה-F1 27 על ידי טבילה רציפה במים סטריליים, מים סטריליים ו-PBS. לאחר שטיפה של הטבילה ב-PBS והמוצר F1 27, נוכל לטבול את המצעים בתמיסת תרבית תאים לבחירתכם. תמיסת תרבית התאים בה טבלתי את ה-EMPAs יכולה להכיל סרום ו/או גורמי גדילה אחרים או תוספי מזון כגון פניצילין וסטרפטומיצין.
כל המרכיבים הללו תואמים לחלוטין לטיפולי EMPAs. עכשיו השלב הבא, לאחר שהעורכים שקעו בתמיסת תרבית תאים הוא לזרוע את התאים הנבחרים על העורכים. עבור מערך ניסיוני ספציפי זה, אני אזרע תאי אנדותל אבי העורקים הריאתי של בקר לשלוש מנות שונות.
הסיבה שאני משתמש בשלוש מנות שונות היא מכיוון שאתייחס לשתיים מהמנות עם מעכבי מישוש ידועים כדי לעכב את הסטיות של העמודים כפי שנוכל לבדוק במועד מאוחר יותר. אז כדי לזרוע את התאים, אני פשוט לוקח את תרחיף התאים שלי, שואב את הכמות המתאימה לתוך הפיפטה ופיפטה טיפה לכל צלחת. אני מוסיף מספיק תאים כך שכאשר אני מבצע את הבדיקה למדידת כוחות המתיחה, התאים קיימים כתאי תא בודדים בעורכים.
הכמות שתוסיף תהיה תלויה באזור ההתפשטות כמו גם בקצב הצמיחה של התאים הספציפיים שלך. בדרך כלל אנו זורעים בין 1500 ל-5,000 תאים לסנטימטר רבוע של מצע. לאחר שסיימתם לזרוע את התאים או לערוך את תרחיף התאים, נדנדו את התרבית בעדינות קדימה ואחורה מספר פעמים בכיוונים אורתוגונליים כדי לערבב את תרחיף התאים לתוך צלחת התרבית.
חזור על תהליך זה עבור כל המצעים שבהם אתה משתמש. מיד לאחר זריעת התאים, הניחו אותם באינקובטור של 37 מעלות ברמה מתאימה של פחמן דו חמצני כדי לחצץ את ה-pH ואת אמצעי תרבית התאים. שעתיים, כשעתיים לאחר זריעת התאים, ראוי לשטוף את התאים על ידי העברת המצעים מצלחת מדיה אחת לצלחת טרייה מאותה מצע תרבית תאים.
הסיבה לשטיפה זו היא שרוב התאים יתחילו להתפשט ויגיעו כמעט לאזור ההתפשטות הסופי שלהם תוך שעתיים. על ידי שטיפת התא, המצעים, אתה מסיר את כל התאים הצפים ממדיום תרבית התא. בדרך זו רק תאים שהתחברו ל-EDS ומתחילים בתהליך התפשטות יופיעו בבדיקת הקצה לכוחות המשיכה.
מבחן אחד שאנו יכולים לבצע עם תאים שגודלו על MPAs הוא הדמיית זמן-lapse כדי לבחון כמותית את הדינמיקה של התכווצות התא. בפרט, שהדינמיקה של התכווצות התאים בתגובה לגורמים מסיסים מעניינת. ידוע כי גורמים מסיסים כגון תרכובות ביולוגיות ותרכובות סינתטיות מגבירים או מפחיתים או משפיעים באופן לא ידוע על התכווצות התאים.
עבור ניסוי תאים חיים זה, נשתמש במיקרוסקופ אפי פלואורסצנטי הפוך זה. בשלב המיקרוסקופ, יש לי קופסת אינקובטור קטנה מחוברת לווסת תרמי כדי לשמור על הטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2. אנו נצלם בהגדלה גבוהה עם יעד APO של תוכנית 60x.
עכשיו נלך להכין את מצע ההשפעה להדמיה. למטרה של פי 60 שאנו משתמשים בה להדמיה יש מרחק עבודה של 200 מיקרון, שהוא הרבה יותר דק מעובי צלחת תרבית הרקמה שבה זרענו את התאים קודם לכן. לכן, איננו יכולים, איננו יכולים לדמות תאים על השתלים בצלחת תרבית הרקמה.
כדי לעקוף את הבעיה הזו, אנו משתמשים בכלי הזכוכית האלה. כעת אעביר את המצע לתבנית תחתית הזכוכית הפוכה כך שהתאים וקצות העמודים יהיו בממשק של צלחת הזכוכית התחתונה. לכן, כאשר זה מונח על המיקרוסקופ, מרחק העבודה בין התאים למטרה הוא פחות מ-200 מיקרון.
עכשיו אנחנו מוכנים ללכת לשים את זה על מיקרוסקופ להדמיה. כעת אפתח את תא החממה של התאים החיים, אכניס את הדגימה פנימה ואחליף את מכסה תא החממה. בשלב זה אסרוק את המצע לאיתור תא מתאים.
לתמונה. הדרך היעילה ביותר לעשות זאת היא להשתמש במטרה של שלב אחד פי 10, שתאפשר לי לראות שדה רחב יותר של המצע ולמצוא תא מהר יותר. הקריטריון שלי לתא טוב הוא לתא בודד.
הוא לא אמור לגעת בתאים שכנים, והוא גם צריך להיות בערך ממוצע בגודלו בהשוואה לכל התאים האחרים על המצע, מצאתי תא מתאים להסתכל עליו. הדבר הבא שאעשה הוא להחליף את המטרה ל-60 x כדי להסתכל על התא בהגדלה גבוהה. כדי לעשות זאת, אנחנו מבטלים את המיקוד של המטרה, כך שהיא לא להקפיץ את הבמה במהלך הרוטציה.
במהלך סיבוב הצריח פתח את החדר, סובב חלקית את הראיון האובייקטיבי 60 x 60 x האובייקט הוא עדשת טבילה בשמן, ולכן עלינו להניח טיפת שמן טבילה על עדשת האובייקט. כעת נסיים לסובב את הטורט כדי להביא את ה-60 x למקומו. נסגור את תא האינקובטור ונמקד מחדש את המטרה כדי להחזיר את התא לפוקוס.
לאחר שכווננתי את המיקום והמיקוד של התא, אעבור למצלמת CCD כך שאוכל להציג תצוגה מקדימה של התא על מסך המחשב ואז להתחיל בהדמיית זמן-lapse. עבור הניסוי הזה, אנחנו, אני אאסוף גם תמונות פאזה וגם תמונות פלואורסצנטיות במרווח של דקה אחת, כך שהדמיית ה-time lapse התחילה ואני אתן לה לרוץ במשך 10 דקות או 10 פריימים, ובשלב זה אוסיף סרום 10 דקות חלפו כעת. בשלב זה אפתח את החדר ואוסיף סרום לתבשיל כדי לעורר את ההתכווצות בתא.
הטיימר עדיין פועל, אז אני צריך להיות מהיר לעשות את זה עכשיו, נמשיך לדמות את התא במשך 30 דקות כדי לעקוב אחר כל שינוי בהתכווצות. לאחר שסיימנו הדמיית דולג זמן, ניתן לרצף את התמונות לסרט המוצג. הנה שני סרטים של תמונות הפאזה והפלואורסצנטיות.
משמאל יש סרט פאזה של תא שקוף ברובו המתוארת בשחור. התא פרוש על פני קצותיהם של 20 עמודים, שהם המבנים העגולים המסודרים בסריג מלבני. מימין סרט פלואורסצנטי של אותו תא, אך רק העמודים נראים לעין.
אם אשמיע את הסרטים האלה, תראו שהעמודים המחוברים לתא הם בהתחלה חלשים, מוסטים וחורגים מעט מאוד מהסריג המלבני. לקראת אמצע הסרט הוספתי נסיוב למדיה. הסרום ממריץ את התא להגביר את ההתכווצות.
ככל שהתא מפעיל כוחות משיכה גדולים יותר על העמודים הבסיסיים, העמודים לאורך היקף התא מתחילים לסטות פנימה. בסרט הפלואורסצנטי, אתה רואה כעת עמודים חורגים באופן משמעותי ממיקומם בסריג המלבני. כפי שאתאר מאוחר יותר, ניתן להשתמש בתזוזה של מיקומי העמודים הללו בתמונות אלה כדי לנתח את כוחות המשיכה של תא זה.
בעבר ראינו כיצד יצרנו את מצעי ה-mpad וכיצד אנו מתפקדים אותם על מנת לתרבית תאים. עכשיו שמתם לב שהנחתי את מצעי ה-mpad המוגמרים לשלוש מנות שונות של תרבית תאים. התאים גדלו בן לילה, ועכשיו מה שאני הולך לעשות זה לטפל בכל צלחת תרבית תאים בנפרד עם חומר מסיס אחר שמווסת את ההתכווצות בצורה ידועה.
לאחר מכן נוכל למדוד בצורה כמותית את כוחות המתיחה הנובעים לאחר תיקון התאים 30 דקות. לאחר הוספת הגורמים המסיסים 30 דקות לאחר הוספת מעכבי ההתכווצות, הגיע הזמן לתקן את התאים עם אלדהיד פרפורמי כדי לנעול את המצב הנוכחי של כוחות המתיחה. לשם כך, חשוב להשתמש באלדהיד פרפורם המכיל סידן ומגנזיום, ואנו משתמשים באלדהיד פרפורמי באחוז נפח של 3.7%השיטה לטבילת המצעים באלדהיד פרפורם, סליחה, זהה לשיטה לטבילת המצעים בזה, ב-RINs השונים במהלך הפונקציונליזציה.
כלומר, חשוב לא לתת למצעים להתייבש מכיוון שהדבר עלול להוביל לקריסה לאחר התמוטטות. לאחר שהעברתי את המצעים, העברתי את המצעים, נתתי להם לדגור באלדהיד הפרפורם למשך 20 דקות. לאחר תום 20 הדקות, אנו מסירים את המצעים מהאלדהיד הפרפורמי עכשיו ועכשיו לאחר שהתאים תוקנו, אנו יכולים לעבד את הדגימות האלה לצביעה חיסונית סטנדרטית.
לשם כך, אנו מניחים את המצעים עם הפנים כלפי מעלה על פרם ופיפטה על מספיק PBS כדי לכסות את המצע ושומרים אותו מתחת ל-PBS. לאחר מכן אנו שוטפים מצע שלוש פעמים עם PBS כדי להסיר כל אלדהיד פרפורמי שעלול להישאר בתרבית. לאחר שטיפת המצע שלוש פעמים עם PBS, אנו יכולים להעביר את המצע לצביעה חיסונית במורד הזרם.
אנו עושים זאת על ידי טיפול במצע עם זוג פינצטה והיפוך בשלב הראשון בצביעה חיסונית, וזה חומר חלחול. במקרה זה, אנו משתמשים ב-0.2%Triton X ב-PBS. עם זאת, המשתמש יכול להשתמש בכל סוכן איזון המתאים ביותר לצרכיו.
אנו חוזרים על כך עבור כל המצעים שלנו וכך אנו מטפלים במצעים במהלך תהליך הכתם החיסוני. לאחר צביעה חיסונית, המצעים מותקנים על שקופית זכוכית סטנדרטית בגודל 1 אינץ' על 3 אינץ', אותה ניתן לעבד לאחר מכן בכל מיקרוסקופ פלואורסצנטי אפי, בין אם הוא הפוך או זקוף. על ידי עיבוד הדגימות במיקרוסקופ קונפוקלי, אנו יכולים להתמקד בתחתית העמודים כדי לקבל את מיקומי האפס.
לאחר מכן אנו יכולים להתמקד עד לקצות העמודים, לצלם תמונה נוספת של העמודים, ועל ידי השוואת התמונה העליונה לעומת התחתונה, אנו יכולים למדוד את הסטיות של העמודים ולחשב את כוחות המשיכה של התאים שהתאים יצרו על מנת לייצר סטיות כאלה. על ידי ביצוע התהליך הזה עבור תאים רבים ושונים בכמה תנאים שונים, אנו יכולים להשוות את כוחות המשיכה שנוצרים בתנאים השונים. כעת, לאחר שאספנו תמונות של תאים חיים וקבועים כאחד, המשימה הבאה היא למדוד את הסטייה, למדוד את כוחות המשיכה בתאים.
לשם כך, לשם כך, כתבנו תוכנת מחשב ב- matlab. אלה שלושת הדימויים בהם נשתמש בניתוח זה. התמונה הראשונה היא תמונת פאזה של התא.
זה מועיל לזיהוי מיקום התא. התמונה השנייה היא תמונה פלואורסצנטית של ראשי העמודים. אנו משתמשים בתמונה זו כדי לאתר את מיקומי העמודים בקצותיהם.
כפי שאתה יכול לראות, חלק מהעמודים הללו מוסטים וחורגים מהסריג המלבני בו נמצאים רוב העמודים כמו הפוסט הזה. והפוסט הזה. התמונה השלישית בה נשתמש היא תמונת הבסיס, הלוכדת את מיקום העמודים ב-a, ב-, במישור מוקד החוצה את הבסיס.
ברמה זו, יש למקם את העמדות המוטות והלא מוסטות בתנוחת המנוחה שלהן, בעמדות לא מוסטות. בסריג המלבני, אתה יכול לראות שהעמודים שהוסטו בתמונה השנייה בבסיסם, הם במצב FL שלהם. תמונה זו משמשת למציאת המיקום של הפוסט זה, זה, זה מתחת למיקום משתקף.
לאחר מכן, אנו טוענים את תוכנית MATLAB, שתנחה אותנו לטעון את שלוש התמונות הללו. תן שם לקובץ. אתם רואים את תמונת הפאזה.
נצייר תיבה סביב המציין היכן נמצא התא, כך שהתוכנית תדע אילו פוסטים לנתח. לאחר מכן התוכנית מבצעת בעוצמה, סף ואופטימיזציה של התמונה החתוכה כדי לקבוע את קואורדינטות ה-OID של הפוסטים. משמאל מופיעות תמונות של פוסטים מהתמונה העליונה ואילו מימין תמונות של אותם פוסטים מתמונת הבסיס.
לאחר השגת הפוסטים, קואורדינטות OID, התוכנה יכולה לאחר מכן לקבוע את וקטורי התזוזה בין הקצה לבסיס של כל עמוד. ניתן להמיר וקטורי פוסט תזוזה אלה לווקטורים של כוח על ידי הכפלתם בקבוע הקפיץ של העמוד. אנו יכולים לנתח את הכוחות התאיים הללו במספר דרכים, כגון כוח ממוצע לתא או כוח ממוצע לעמוד.
תוצאה שימושית אחת היא תרשים רעד שממנו אנו יכולים לדמיין את ההתפלגות המרחבית של הכוחות. זה התא שזה עתה ניתחנו ואתם יכולים לראות ששמתי חיצים צהובים על העמודים שמתאמים עם גודל הכוח והנקודה בכיוון הכוח. על ידי חזרה על תהליך ניתוח תמונה זה עבור תמונות רצפים כמו אלה הנדרשות בסרט ה-Time lapse שלנו, אנו יכולים ליצור רצף זמני.
הנה סרטון של התא שגירינו עם סרום. כפי שאתה יכול לראות, בדיוק כפי שנוסף הנסיוב, התא הגביר את ההתכווצות והסיט את העמודים עוד יותר. בנוסף, אנו יכולים לכמת כוחות עבור מספר גדול יותר של תאים שהיו נתונים לתנאים שונים ולאחר מכן קבועים מוכתמים כפי שמודגם על ידי עלילות הרטט הללו המציגות תא שטופל בתרכובת ביקורת לעומת תאים שטופלו במעכבי התכווצות.
ככל שאתה יכול. כפי שאתה יכול לראות, וקטורי הכוח על התא במקרה הבקרה גדולים יותר באורך מאשר וקטורי הכוח. בשני המקרים שבהם נעשה שימוש במעכבי ההתכווצות, כיסינו כאן חומר רב כדי לתאר את מצע הנתיב מייצור מיקרו ועד הכנת דגימות, ניסויים וניתוח כדי להדגים את הרבגוניות הרב-תכליתית של מצעים אלה.
תיארנו שתי בדיקות שונות, הדמיית תאים חיים ובדיקת דגימה קבועה, ועשינו ניתוח של תאים שהתקבלו משתי הבדיקות הללו והראינו עלילות רטט וסרטי רטט. בעזרת כלי רב עוצמה זה, ניתן לבצע מגוון של ניתוח מרחבי וזמני של התכווצות התאים. כפי שראיתם, שיטה זו נשענה על דיסציפלינות רבות ושונות, כולל אלה ממיקרו-ייצור, ביולוגיה בסיסית של התא, מדעי פני השטח, ניתוח ועיבוד תמונה ורבים אחרים.
ודווקא בגלל שהשיטה שלה מבוססת על מספר טכניקות הנדסיות שונות, ניתן להתאים את הפרמטרים כגון פוסט גיאומטריה, גורמים מסיסים המושרים ושיטות לניתוח סטיות פוסט בהתאם לצרכי המשתמש. אנו מקווים שההדגמה החזותית של שיטה זו שתיארנו ב-20 או 30 הדקות האחרונות תוכל לשמש כנקודת מוצא לניתוחים אחרים ועמוקים יותר של הוויסות, ההשלכות התפקודיות והיצירה של כוחות משיכה תאיים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
סרטון זה מדגים את ייצורם והשימוש בגלאים ממוזערים מסוג מערך עמודים (mPADs) להערכת כוחות התכווצות תאים. הגישה מאפשרת מדידה של כוחות משיכה תאיים, שהם חיוניים לתהליכים פיזיולוגיים שונים.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- ביולוגיה תאית
- ביומכניקה
- טכניקות מיקרו-ייצור
רקע
- כוחות מתיחה נוצרים דרך אינטראקציות של מיוזין ואקטין.
- כוחות אלו ממלאים תפקיד משמעותי בתנועת תאים והיווצרות רקמות במהלך ההתפתחות.
- הם גם חיוניים לריפוי פצעים והיגירת לויקוציטים.
- הבנת כוחות אלו יכולה לספק תובנות על התנהגות תאים ופיזיולוגיה.
מטרת המחקר
- למדוד כוחות משיכה תאיים באמצעות mPADs.
- לחקור את תפקידם של כוחות מתיחה בתהליכים פיזיולוגיים.
- לשפר את ההבנה של מנגנוני התכווצות תאים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ייצור של גלאים ממוזערים מסוג מערך עמודים (mPADs).
- מדידת כוחות מתיחה הנוצרים על ידי תאים.
- ניתוח של שינויים בהתכווצות התאים.
- יישום של ממצאים בהקשרים פיזיולוגיים.
תוצאות עיקריות
- ייצור מוצלח של mPADs למדידת כוחות תאיים.
- הדגמה של הקשר בין כוחות מתיחה להתנהגות תאים.
- תובנות על מנגנוני תנועת תאים והתכווצותם.
- יישומים פוטנציאליים בהבנת התפתחות ורפוי רקמות.
מסקנות
- mPADs הם כלים יעילים להערכת התכווצות תאים.
- הבנת כוחות מתיחה יכולה לספק מידע לביולוגיה פיזיולוגית והתפתחותית.
- מחקר עתידי עשוי להרחיב את היישומים של טכנולוגיה זו בהקשרים ביולוגיים שונים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Measuring cellular traction forces provides critical insight into mechanobiology pathways that influence target validation in oncology, fibrosis, and immunology. The mPAD platform enables quantitative, spatially resolved assessment of contractility, supporting mechanistic de-risking of therapeutic hypotheses involving cell migration, invasion, or tissue remodeling. By converting post deflection into force vectors, the method delivers predictive confidence in early discovery by linking molecular perturbations to functional biomechanical outputs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic targets through direct measurement of cellular contractility changes induced by genetic or pharmacological modulation.
- Operational Value: Supports target de-risking by correlating traction force modulation with pathway activity in disease-relevant cellular models.
- Predictive Value: Facilitates lead identification by quantifying compound effects on force generation, providing a functional readout beyond viability or proliferation assays.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible microenvironments where cells deflect elastomeric posts, enabling consistent traction force quantification across compound screens.
- Quantitative Output: Delivers displacement vectors convertible to force measurements, supporting dose-response analysis and hit selection in contractility-modulating compound libraries.
- Scalability: Compatible with live-cell imaging and fixed-endpoint workflows, allowing integration into automated microscopy platforms for medium-throughput screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models pathophysiological processes such as cancer metastasis and vascular remodeling where aberrant traction forces drive pathology.
- Translational Continuity: Bridges in vitro contractility measurements to in vivo tissue-level behaviors, supporting extrapolation to preclinical efficacy and safety assessments.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables go/no-go decisions based on whether a compound normalizes pathological force signatures in relevant cell types.
Pipeline & Workflow Integration
The mPAD method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead optimization, particularly for programs focused on cytoskeletal regulators, adhesion molecules, or mechanotransduction nodes. It complements biochemical assays by adding a functional, biomechanical layer of validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring how perturbations in myosin-actin dynamics or upstream signaling affect cellular force generation.
- Screening: Enables assay standardization through defined post geometry and PDMS material properties, ensuring reproducible deflection measurements across wells and plates.
- Analytics: Provides quantitative displacement and force vector outputs that allow comparison of contractility states across conditions, time points, or genetic backgrounds.
- Translational Research: Connects cellular contractility to tissue-level outcomes such as wound healing or tumor invasion, when supported by disease-model context.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable platform technology where post dimensions and surface chemistry can be adapted to different cell types or study goals without revalidating core fabrication principles.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing direct, physical readouts of cellular contractility linked to molecular interventions.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized fabrication, surface functionalization, and imaging protocols that minimize variability in force measurements.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early identification of compounds with unwanted effects on cell motility or tissue integrity, reducing late-stage attrition.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by distinguishing compounds that modulate pathological versus physiological contractility in relevant models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfabrication, PDMS handling, and fluorescence microscopy for reliable substrate generation and imaging.
- Depends on access to cleanroom facilities for SU-8 master fabrication and plasma treatment equipment for surface functionalization.
- Necessitates standardization of cell seeding density, incubation times, and fixation protocols to ensure comparable traction force measurements across experiments.
- Involves adaptation considerations when transferring the assay to different cell types, as post size and spacing must be optimized for cellular spreading and force detection limits.
- Includes practical limitations such as the need for careful handling to prevent post collapse and the requirement for specialized image analysis tools to convert deflection data into force vectors.
