Transfecting וNucleofecting תאי גזע אנושיים pluripotent מושרים

המטרה הכללית של ניסוי זה היא להשיג יעילות טרנספקציה גבוהה בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים של בני אדם באמצעות פרוטוקולי טרנספקציה והחדרה גרעינית מותאמים. מטרה זו מושגת ראשית על ידי הקמת תרביות של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים של בני אדם ללא תאי מאכל (feeder-free). לצורך הטרנספקציה, תאי הגזע הפלוריפוטנטיים המושריים של בני אדם נזרעים על gelt, TRX או matrigel למשך לילה.

בעוד שביחס להחדרה גרעינית, מתקבלים גושי תאים קטנים באמצעות טריפסין, מתווספת לתאים המפוזרים תערובת של פלסמיד DNA וריאגנט טרנספקציה Gene Juice, ולאחר מכן הצלחת מוסבבת ומודגרת בטמפרטורה של 37 °C. תרחיף תאי iPS אנושיים עובר החדרה גרעינית במכשיר להחדרה גרעינית, והתאים מוסuspendedים מחדש במצע מותנה ב-meth ומודגרים בטמפרטורה של 37 °C. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות מניפולציה גנטית יעילה באמצעות יעילות טרנספקציה גבוהה בתאי iPS אנושיים.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון שיטות טרנספקציה באמצעות אלקטרופורציה והחדרה גרעינית שתוארו בעבר, הוא שניתן להשיג במעבדתנו באופן שגרתי יעילות טרנספקציה גבוהה בתאי IPS אנושיים עם תוצאות עקביות. הפרוטוקולים שלנו מבטיחים גם מוות תאי מינימלי לאחר שינוי גנטי. לפיכך, הפרוטוקולים שלנו מאפשרים יצירה מהירה ובהיקף נרחב של תאי IPS אנושיים טרנסגניים. לפני התאמת תאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים אנושיים לתרביות ללא תאי מאכיל (feeder-free), הכינו צלחות מצופות gelt TRX.

בשלב הבא, שטפו את תאי ה-IPCs האנושיים, ששומרו קודם לכן על תאי מאכיל (feeder cells), בנפח של 1 mL של Accutane לבאר, והדגרימו בטמפרטורה של 37 °C למשך דקה אחת ועד שמרבית התאים יתחילו להיפרד. הוסיפו 10 עד 15 כדוריות זכוכית לתאים ונערו בעדינות את הפלטה. לאחר מכן, הוסיפו 2 mL של knockout D-M-E-M-F 12 ובצעו טריטורציה עדינה. העבירו את תרחיף התאים למבחנה לצנטריפוגה בנפח של 10 mL.

סובבו את התאים ב-800 RPM למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. שאבו את העל-נוזל, והשאירו את משקע ה-human IPSC שלם. נכו את המבחנה בעדינות כדי לפזר את משקע התאים בעדינות.

ריס, השעה את משקע ה-human IPSC בנפח מתאים של STEM pro medium וחלק אותו בין בארות של פלטת gel TRE coated. בהתאם לקצב השכפול, ניתן להעביר human IPCs ביחס פיצול של 1:2 עד 1:6. הנח בזהירות את הפלטה בתוך אינקובטור ב-37 degrees Celsius ו-5% carbon dioxide, וסובב את הפלטה בעדינות כדי להבטיח פיזור אחיד של התאים בין הבארות.

יש להאכיל את התאים מדי יום. כאשר התאים מגיעים ל-80% confluence, הם מוכנים להעברה חוזרת לג'ל חדש. באר מצופה ב-Rex, ביחס פיצול של אחת לשתיים של תאים, צריכה להיות בערך ב-40% עד 50% confluence ובמושבות קטנות המפוזרות באופן אחיד על פני הבאר המצופה בג'ל ביום הטרנספקציה, כדי להשיג יעילות טרנספקציה אופטימלית.

כדי להתחיל בהליך זה, הכין 100 µL של מצע knockout במבחנה סטרילית בתנאי eend orph בנפח 1.5 mL. הוסף 27 µL של ריאגנט טרנספקציה gene juice, ערבב היטב והדגר בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר מכן, הוסף 4 µg של DNA פלסמיד.

בחירת הפלסמיד היא קריטית להשגת יעילות טרנספקציה אופטימלית. הפלסמיד שנעשה בו שימוש כאן מכיל חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר המונח תחת מקדם CAG, وهو מקדם חזק הפעיל באופן תעתוקי בתאי IPC אנושיים. דגרו את המבחנה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.

לאחר 15 דקות, הוסף לתאים את תערובת ה-DNA (gene juice) והנח ללוחית להתנפח. סובב את הלוחית במהירות של 1,200 RPM למשך חמש דקות כדי להגביר את המגע של תערובת הטרנספקציה עם ה-IPCs האנושיים בבאר. דגור את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך לילה, עד ליום המחרת.

יש לעקוב אחר יעילות הטרנספקציה ביום הפעולה; לפני כן, טפל את תאי ה-IPC האנושיים ב-10 µM של מעכב ROCK למשך שעה אחת לפחות בטמפרטורה של 37 °C. במהלך הטיפול המקדים בתאי ה-IPS CS האנושיים, הכן 82 µL של תמיסת nuclear effector לתאי גזע אנושיים בתוך פרונטה סטרילית של 1.5 mL. הוסף 80 µL.

הוסיפו תוסף אחד וערבבו היטב באמצעות פיפטור. דגרו את התמיסה בטמפרטורה של 37 °C למשך חמש דקות. חממו מראש, בתוך המנדף, מצע תגובה מותנה של תאי מאכיל (feeder cell conditioned media) שהוכרתו מראש ו-0.25% trypsin-EDTA לטמפרטורה של 37 °C.

סמנו מראש מבחנה קונית סטרילית אחת בנפח 15 milliliter. הסירו בזהירות את המצע מתרבית ה-human IPSC המיועדת להשפעה גרעינית, ושטפו בעדינות את התאים באמצעות phosphate buffered saline. שאבו את ה-PBS והוסיפו trypsin; דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך שלוש דקות.

על מנת להשיג התמרה גרעינית מוצלחת, קריטי שלא להשתמש בטריפסין כדי לפרק את התאים לתאים בודדים. במקום זאת, יש לבצע טריטורציה לתאים לקבלת גושים קטנים המורכבים משני עד שלושה תאים. העבירו בעדינות את התאים באמצעות טיפ של פיפט P 1000 לגושים קטנים המורכבים משני עד שלושה תאים.

שטפו את תחתית הבאר באמצעות פיפטציה חוזרת כדי לוודא שכל ה-IPCs האנושיים התנתקו לחלוטין. לאחר מכן, העבירו את תרחיף התאים למסורת קונוית רשומת של 15 milliliter. לאחר מכן, הוסיפו תשעה milliliters של מצע גידול לפיברובלסטים עובריים של עכבר.

כדי לנטרל את ה-tripsin, סובבו את התאים ב-800 RPM למשך שלוש דקות. שאבו בזהירות את ה-SUP natant תוך השארת משקע התאים שלם. השביו את התאים ב-100 µL של תמיסת effector גרעינית לתאי גזע אנושיים שחוממה מראש.

העבירו תאים לתוך ווטה של אפקטור גרעיני באמצעות טיפ פנפיפט של 1 mL. הוסיפו 4 µg של DNA פלסמיד לס 가수ס התאים בתוך הווטה, וערבבו את התאים וה-DNA באמצעות סיבוב עדין. הקישו את הווטה פעמיים על משטח המCהוד.

הכנס את ה-vete למחזיק האפקטור הגרעיני של מכשיר האפקטור הגרעיני. בחר בתוכנית B 0 1 6 nuclear effect cells על ידי לחיצה על כפתור x. המילה Okay תוצג כאשר תהליך ההשפעה הגרעינית יסתיים, דבר שלרוב אורך בין שנייה אחת לחמש שניות. השתמש בפיפט הפלסטיק שסופק בערכת האפקטור הגרעיני כדי לשלוף תאים שעברו השפעה גרעינית מה-vete. שחזר את התאים על ידי ריסוף (Resus), השעיה שלהם ב-CM ובמעכב רוק (rock inhibitor) שחוממו מראש בתוך פרוביקט סטרילי בנפח 1.5 milliliter. דגראת את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך 10 דקות.

לאחר 10 דקות, השתמש בקצה פפית של מיליליטר אחד כדי להעביר את התאים בטיפות על שכבות המזינות (feeder layers). דגור את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך הלילה. עקוב אחר יעילות הטרנספקציה.

מוצגות כאן פוטומקרוגרפיות של תאי RIV one human IPSC המבטאים EGFP, אשר עברו טרנספקציה באמצעות gene juice on gel Rex כ-12 שעות לאחר טרנספקציית הפלסמיד. טרנספקציית DNA של תאי human IPSC באמצעות gene juice עם פרומוטר חזק מניבה בדרך כלל יותר מ-60% תאים המבטאים את הדיווח EGFP במבחן טרנספקציה זמנית.

ניתן להשיג תאים המבטאים EGFP גם באמצעות נוקלאופקציה, כפי שמוצג בתמונות אלו של תאי IPCs אנושיים של RIV one שנספחו והתגבשו על תאי מאכיל (feeders) לאחר נוקלאופקציה באמצעות תוכנית הנוקלאופקציה B 0 1 6 או תוכנית הנוקלאופקציה A 0 2 3. שימוש בתוכנית B 0 1 6 מוביל לעד 80% של תאים חיוביים ל-EGFP, בעוד שתוכנית A 0 2 3 הניבה פחות מ-10% תאים חיוביים ל-EGFP. יתרה מכך, ניתן להפיק שיבוטים (clones) יציבים של תאי iPSCs אנושיים טרנסגניים המבטאים את הגן trends.

כאן מוצגת דוגמה למושבות של תאי גזע אנושיים מושרוצים (iPSC) המביעים EGFP יציב, עם ביטוי EGFP בכל התאים שנגזר מ-gene juice. תאים אלו שומרים על ביטוי קונסטיטוטיבי של EGFP במהלך התמיינות לגוף עוברי. לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של אופן הטרנספקציה של תאי iPSC אנושיים.

מניפולציה גנטית יעילה היא כלי חיוני לחקר היבטים שונים של ביולוגיה של תאי גזע, ותאיץ את השימוש בקווי תאי iPS אנושיים ברפואה רגנרטיבית.