Name: Transfecting וNucleofecting תאי גזע אנושיים pluripotent מושרים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: למד פרוטוקולים מותאמים לטרנספקציה ונוקלאופקציה בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים מושרים (iPSCs). שיטות אלו מאפשרות מניפולציה גנטית יעילה עם תמותת תאים מינימלית ליצירת קווי תאים טרנסגניים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

העבודה מתוארת בכתב היד הזה התאפשר הודות למימון ממכון קליפורניה לרפואת הרגנרציה (CIRM) לליבת תאי גזע UCR.

הפרוטוקול שלנו מתחיל בשיטה להתאים iPSCs אדם לתרבויות נטולות מזין, ואחרי פרוטוקולים לtransfecting iPSCs אדם באמצעות GeneJuice וnucleofection של iPSCs אדם באמצעות מכשיר nuclefector AMAXA (EMD). הערה: ההליכים הבאים יבוצעו בברדס זרימה למינרית סטרילי. כל כלי התקשורת והפתרונים הם מתאזנת עד 37 ° C או טמפרטורת חדר לפני התחילה אלא אם צוין אחר. 1. הקמת iPSCs אדם במערכת מזין חינם iPSCs אדם נשמר בעבר בתאים מזינים ניתן לפצל, מועבר על גבי צלחת Geltrex מצופית ונשמר במשך שתי פסקאות לפני transfection מזין חינם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשר Geltrex הלילה ב 4 ° C. כדי להכין את ציפוי Geltrex, לדלל להפשיר Geltrex 1:50 בDMEM הקר. מערבב בעדינות את הפתרונים. </li></ol> הערה: Geltrex, כמו Matrigel היא צורה מסיסה של matr קרום המרתףix מטוהר מעכברי Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) תאים סרטניים. לחלופין, Matrigel יכול לשמש כמטריצה ​​להקים תרבויות iPSC אדם מזין חינם. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את כל פני השטח של בארות תרבות עם Geltrex פתרון (1 מ"ל ל35-מ"מ היטב). מעייל עם בארות Geltrex על 37 מעלות צלזיוס חממה במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לiPSCs מעבר אדם, להוסיף 1 מ"ל של accutase לטוב ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות עד שרוב התאים להתחיל לניתק. </li></ol> לiPSCs מעבר אדם, להוסיף 1 מ"ל של accutase לטוב ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות עד שרוב התאים להתחיל לניתק. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10-15 חרוזי זכוכית לתאים ועדינות עיטורי הצלחת. הוסף 2 מ"ל של נוקאאוט DMEM / F12 ועדינות triturate. העברת השעית תא לצינור צנטריפוגה 10 מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין תאים ב800 סל"ד ל3 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant מהצינור, ומשאיר אדם iPSC גלולה ללא פגע. עדינות קפיצית לצינורלפזר תא גלול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר Geltrex מהבאר המצופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend iPSC גלולה אנושית עדינות בנפח מתאים של STEMPRO. להפיץ בין בארות של מתקני האכלה, תלוי בשיעור ההפצה). iPSCs אדם ניתן passaged ביחס פיצול של 1:02-01:06. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות מקום לCO 2 חממה 5%, מערבולת הצלחת בקפידה כדי להבטיח חלוקה שווה של תאים ברחבי הבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי הזנה יומיים עד תאים מוכנים לנפרד שוב (כאשר תאים להגיע 80% confluency). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> iPSCs Passage אדם על כן Geltrex המצופה חדש (שלב 1.3-1.9) בביחס פיצול של 1:2. מושבות קטנות צריכות להיוצר ומתחלקות באופן שווה על מצופה Geltrex היטב לפני transfection. </li></ol> 2. Transfection של iPSCs אדם עם GeneJuice תאים (גדל על צלחות 6-כן) צריכים להיות כ -40% -50 confluent ביום transfection כדי להשיג יעילות transfection אופטימלית. זהאין צורך לשנות את המדיום הסלולרי עד ליום המחרת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 100 KO-DMEM/F12 μl בצינור סטרילי 1.5 מ"ל אפנדורף. הוסף מגיב transfection GeneJuice μl 27. מערבב היטב. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 4 DNA פלסמיד מיקרוגרם. דגירת הצינור בטמפרטורת חדר במשך 15 דקות. הבחירה של פלסמיד היא קריטית ליעילות transfection אופטימלית. אנו משתמשים בפלסמיד עם חלבון משופר ירוק פלואורסצנטי (eGFP) מונע על ידי אמרגן CAG 5 (pCAG-eGFP). CAG אמרגן הוא אמרגן חזק שהוא תעתיק פעיל בiPSCs אדם ולכן ניתן להשתמש בכונן ביטוי transgene בתאים אלה. בידות שלנו, linearization של פלסמיד לא נראה להשפיע על יעילות transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף תערובת GeneJuice-DNA לתאים וקרונות הצלחת. ספין הצלחת ב 1200 סל"ד במשך 5 דקות (השיטה 'spinoculation') כדי להגדיל את הקשר של תערובת transfection עם iPSCs אדם על הבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת התאים ב 37 &amp;מעלות; C למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח על יעילות transfection למחרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לtransfection היציב, לשנות בינוני למחרת עם STEMPRO טרי. הוסף בחירת אנטיביוטיקה מתאימה אחרי 24 - 48 שעות. </li></ol> 3. Nucleofection של iPSCs אדם iPSCs אדם גדל על מתקני האכלה או Geltrex יכול לשמש לnucleofection. עם זאת, אנו ממליצים בחום replating iPSCs האדם nucleofected על פיברובלסטים עכבר עובריים (MEF) או פיברובלסטים עורלה אנושיים (HFF) ניזונים כדי להבטיח כדאיויות תא גבוהות והתאוששות. לפחות 2 מיליון תאים יש להשתמש כדי להשיג הישרדות תא גבוהה יותר בעקבות nucleofection. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תקשורת הממוזגת מזין תאים (CM) על ידי דוגר נוקאאוט iPSC אדם החלפת מדיה סרום (KOSR) עם תאים מזינים בן לילה. איסוף CM כל 24 שעות. </li></ol> הערה: כל עכבר זן המשמש להכנת שכבות מזינות (כגון BLK6, CF1 וMF1) מתאימה לשימוש for עושה סי. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום nucleofection, טרום לטפל iPSCs אדם עם מעכב ROCK מיקרומטר 10 לפחות שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 82 μl של פתרון nucleofector תאי גזע אנושי בצינור סטרילי 1.5 מ"ל אפנדורף. הוסף תוסף 1 18 μl. מערבב היטב. דגירת פתרון על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקשורת מזין מראש חם תא ממוזג (CM) ו0.25% טריפסין / EDTA עד 37 ° C. מתחת למכסה המנוע, prelabel צינור אחד סטרילי 15 מיליליטר חרוטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות מתקשורת תרבות iPSC האנושית להיות nucleofected. לשטוף בעדינות את התאים עם פתרון 2 מ"ל 1X פוספט שנאגר (PBS) לטוב. לשאוב PBS. הוסף 1 מ"ל של טריפסין 0.25% לטובים. דגירת תאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עדינות triturate התאים עם טיפ 1000 מ"ל פיפטה. שטוף את תחתית הבאר כדי לוודא שכל iPSCs האדם מנותק לגמרי. העברת השעית תא לצינור כותרתו 15 מיליליטר חרוטים. </li></ol> הערה: לאחת Trypsinization גאמות בהחלט יש להימנע. תאים צריכים לעזוב רק לתוך גושים קטנים של תאים, מונה כשלישייה של תאים. גושים קטנים של תאים (תאי לשות) יהיו ניתקו לתוך תאים בודדים בטיפול הבא של התאים. <ol start="7" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 9 מ"ל MEF תקשורת להשבית טריפסין. ספין תאים ב800 סל"ד במשך 3 דקות. בזהירות לשאוב supernatant ולהשאיר גלולת התא שלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים ב100 μl prewarmed של פתרון אנושי מתאי הגזע nucleofector שלב 3.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת תאים לקובט nucleofector באמצעות טיפ 1 מיליליטר פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 4 מיקרוגרם של DNA פלסמיד לתוך השעית התא בקובט. מערבב תאים ו-DNA על ידי מתערבל עדין. קש קובט פעמים על פני שטח מכסה המנוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את קובט לתוך מחזיק nucleofector. השתמש בתוכניות B-016. תאי Nucleofect על ידי לחיצה על הכפתור X. </li></ol> &lt; <ok> &gt; יוצג בעת תהליך nucleofection הוא completאד (בדרך כלל לוקח 1-5 שניות בלבד). השימוש בתוכניות nucleofection אחרות (-023, ו-U-033-023) הניב פחות מ 10% מתאים eGFP חיוביים מiPSCs אדם. </ok><ol start="12" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יחזרו תאי nucleofected מקובט באמצעות פיפטה ספקה פסטר הפלסטיק. שחזור תאים על ידי resuspending בסנטימטר prewarmed ומעכב ROCK לתוך צינור סטרילי 1.5 מ"ל אפנדורף. דגירת תאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי לאפשר תאים להתאושש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי העברה-חכמים שחרר אל שכבות מזין באמצעות טיפ 1 מ"ל פיפטה. דגירת התאים ב 37 ° C למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח על יעילות transfection למחרת. לגזור שיבוטים יציבים של iPSCs אדם המהונדס שיציבות להביע transgene, לשנות בינוני למחרת עם CM ומעכב ROCK. הוסף בחירת אנטיביוטיקה מתאימה אחרי 24 - 48 שעות. </li></ol> 4. נציג תוצאות: <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3110/3110fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1">

<ol><li>Liew, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cells%3A+possibilities+for+human+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Med%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cells: possibilities for human cell transplantation.</a> Ann Med. 37, 521-532 (2005).</li>
<li>Eiges, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+human+embryonic+stem+cell-transfected+clones+carrying+a+marker+for+undifferentiated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Establishment of human embryonic stem cell-transfected clones carrying a marker for undifferentiated cells.</a> Curr Biol. 11, 514-518 (2001).</li>
<li>Zwaka, T. P., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogous+recombination+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Homogous recombination in human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 21, 319-321 (2003).</li>
<li>Siemen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleofection+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Nucleofection of human embryonic stem cells.</a> Stem Cells Dev. 14, 378-383 (2005).</li>
<li>Liew, C. G., Draper, J. S., Walsh, J., Moore, H., Andrews, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+and+stable+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 25, 1521-1528 (2007).</li>
<li>Xia, X., Ayala, M., Thiede, B. R., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro-+and+in+vivo-induced+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells+and+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">In vitro- and in vivo-induced transgene expression in human embryonic stem cells and derivatives.</a> Stem Cells. 26, 525-533 (2008).</li>
<li>Braam, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+genetic+manipulation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved genetic manipulation of human embryonic stem cells.</a> Nat Methods. 5, 389-392 (2008).</li>
<li>Braam, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-free+culture+of+human+embryonic+stem+cells+in+conditioned+medium+for+efficient+genetic+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Feeder-free culture of human embryonic stem cells in conditioned medium for efficient genetic modification.</a> Nat Protoc. 3, 1435-1443 (2008).</li>
<li>Hohenstein, K. A., Pyle, A. D., Chern, J. Y., Lock, L. F., Donovan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleofection+mediates+high-efficiency+stable+gene+knockdown+and+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Nucleofection mediates high-efficiency stable gene knockdown and transgene expression in human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 26, 1436-1443 (2008).</li>
<li>Placantonakis, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAC+transgenesis+in+human+embryonic+stem+cells+as+a+novel+tool+to+define+the+human+neural+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">BAC transgenesis in human embryonic stem cells as a novel tool to define the human neural lineage.</a> Stem Cells. 27, 521-532 (2009).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

תוצאת פרוטוקולינו בטכניקות פשוטות, חזקות ולשעתק מאוד להציג transgenes לiPSCs אדם ללא השפעה רעילה בולטת ומוות של תאים. iPSCs אדם צריך להיות passaged לתוך גושים קטנים יותר של תאים (תאים 5-10) ומצופה על Geltrex בצפיפות גבוהה (1:2) על מנת להבטיח יעילות אופטימלית transfection במושבות קטנות רבות. לקווי iPSC אדם שנוטים יותר למות בידול ותא, מספר גבוה יותר של iPSCs אדם (עד 4 X 10 6 תאים) אמור לשמש לניסוי nucleofection אחת. assay transfection חלוף יוצר מספר גדול של transgene-לבטא iPSCs אדם ביום 1. שיבוטי iPSC transfected ביציבות בדרך כלל מופיעים בתוך 7 ימים, והמושבות המהונדסות האלה צריכות להיות מוכנות שיבואו לקחת בתוך שלושה שבועות. השימוש במקדם CAG מתואר כאן מבטיח ביטוי בכל מקום בכתב eGFP. תחת שיפורים כאלה, הפרוטוקולים שלנו יכולים להיות מוזנים לתוך יישומים אחרים, כולל ביטוי יתר, גאינדוקצית onditional, גזירה של קווי שושלת ספציפיים כתב, shRNA או מציאת siRNA, גן המיקוד ורקומבינציה ההומולוגית.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> טריפסין 0.25% עם EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25200056 </td><td></td></tr><tr><td> 2-Mercaptoethanol </td><td> Invitrogen </td><td> 21985-023 </td><td></td></tr><tr><td> 3 חרוזי זכוכית מ&quot;מ </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 11-312A </td><td> חרוזי זכוכית יש לשטוף עם חומצה הידרוכלורית (HCl) בלילה, שטפה עם נתרן הידרוקסידי (NaOH) ומים מזוקקים, ומעקרים על ידי חיטוי לפני השימוש. </td></tr><tr><td> מגיב דיסוציאציה תא Accutase </td><td> Invitrogen </td><td> A11105-01 </td><td></td></tr><tr><td> גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (bFGF) </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0263 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM (רמת סוכר גבוה) </td&gt; <td> Lonza </td><td> 12-741 F </td><td></td></tr><tr><td> עוברי עגל בסרום </td><td> Invitrogen </td><td> 16000044 </td><td></td></tr><tr><td> Geltrex </td><td> Invitrogen </td><td> 12760013 </td><td> גורם גדילה מופחתת </td></tr><tr><td> מגיב transfection GeneJuice </td><td> EMD Biosciences </td><td> 70967 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamax-(100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 35050061 </td><td> L-גלוטמין (Invitrogen, 25030081) יכול לשמש גם במקום. </td></tr><tr><td> iPSC אדם KOSR תקשורת </td><td></td><td></td><td> 500 מיליליטר האדם ES תקשורת מורכבת של 390 המ&quot;ל DMEM נוקאאוט / F12, Replacer הסרום נוקאאוט 100 מ&quot;ל, 5 מיליליטר Glutamax-(100X), NEAA 5 מ&quot;ל (100X), 500 μl 2-Mercaptoethanol (55mm) והשלימה עם 10 ng / ml bFGF . </td></tr><tr><td> נוקאאוט DMEM/F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 12660-012 </td><td></td></tr><tr><td>החלפת סרום נוקאאוט (KOSR) </td><td> Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td></td></tr><tr><td> תקשורת פיברובלסטים העוברי של עכבר </td><td></td><td></td><td> MEF התקשורת מכילה 90% FBS, 1X NEAA, 1X Glutamax-I ו-פירובט נתרן 1X בDMEM (רמת סוכר גבוה) </td></tr><tr><td> חומצת אמינו חיוני שאינן, NEAA? (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 11140050 </td><td></td></tr><tr><td> פתרון אנושי בתאי גזע nucleofector 1 עם תוספת </td><td> Lonza </td><td> VAPH-5012 </td><td></td></tr><tr><td> פוספט נאגר מלוח ללא Ca 2 + וMg 2 + </td><td> Invitrogen </td><td> 10010023 </td><td></td></tr><tr><td> פירובט נתרן (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 11360070 </td><td></td></tr><tr><td> STEMPRO הבינוני ערכה </td><td> Invitrogen </td><td> A1000701 </td><td> 500 מ&quot;ל STEMPRO תקשורת מורכבת מנוק המ&quot;ל 454מתוך DMEM / F12, 10 מיליליטר תוסף STEMPRO סרום ללא צמיחה (50x), 5 מ&quot;ל Glutamax-(100X), 5 מ&quot;ל NEAA (100X), 36 המ&quot;ל BSA (שור אלבומין, 25%), 909 μl 2-Mercaptoethanol (55mm ) והשלים עם 10 ng / ml bFGF. </td></tr></tbody></table>

transfecting וnucleofecting תאי גזע אנושיים pluripotent מושרים

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

שינוי גנטי ממשיך להיות כלי חיוני בלימוד ביולוגיה של תאי גזע וביישומים קליניים המפרט פוטנציאליים של תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) 1. למרות השיפור במספר שיטות מסירת גן תואר 2-9, transfection נותר תהליך קפריזי לhESCs, ועדיין לא דווח בתאים אנושיים מושרים pluripotent גזע (iPSCs). בסרטון הזה, אנחנו מדגימים איך המעבדה שלנו באופן שגרתי וtransfects nucleofects iPSCs אדם באמצעות פלסמיד עם חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר כתב (eGFP). iPSCs אדם מותאם ומתוחזק כתרבויות מזין חינם כדי לשלול את האפשרות של transfection תא מזין ויעילה המאפשרת בחירה של שיבוטי iPSC מהונדסים יציבים לאחר transfection. לnucleofection, iPSCs אדם מראש שטופל במעכבי רוק 11, trypsinized לתוך גושים קטנים של תאים, וnucleofected replated על מתקני האכלה במזין תא ממוזגבינוני כדי לשפר את התאוששות תא. iPSCs האדם transgene מבטא-ניתן לקבל לאחר 6 שעות. בחירת אנטיביוטיקה חלה לאחר 24 שעות וקווים הטרנסגניים יציבים מופיעות בתוך השבוע 1. הפרוטוקול שלנו הוא חזק ולשעתק לקווי iPSC אדם מבלי לשנות pluripotency של תאים אלה.

למרות הפיתוחים אחרונים בהתאמה גנטית, transfection של תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) נותר תהליך גחמני. למיטב ידיעתנו, שיטות שיטתיות ויעילות לתאי אדם transfect מושרים pluripotent גזע (iPSCs) לא דווחה. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים עמידים ביעילות transfect וnucleofect iPSCs אדם.

Transfecting וNucleofecting תאי גזע אנושיים pluripotent מושרים

שינוי גנטי ממשיך להיות כלי חיוני בחקר ביולוגיה של תאי גזע ובגיבוש יישומים קליניים פוטנציאליים של בני אדם...

המטרה הכללית של ניסוי זה היא להשיג יעילות טרנספקציה גבוהה בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים של בני אדם באמצעות פרוטוקולי טרנספקציה והחדרה גרעינית מותאמים. מטרה זו מושגת ראשית על ידי הקמת תרביות של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים של בני אדם ללא תאי מאכל (feeder-free). לצורך הטרנספקציה, תאי הגזע הפלוריפוטנטיים המושריים של בני אדם נזרעים על gelt, TRX או matrigel למשך לילה.בעוד שביחס להחדרה גרעינית, מתקבלים גושי תאים קטנים באמצעות טריפסין, מתווספת לתאים המפוזרים תערובת של פלסמיד DNA וריאגנט טרנספקציה Gene Juice, ולאחר מכן הצלחת מוסבבת ומודגרת בטמפרטורה של 37 °C. תרחיף תאי iPS אנושיים עובר החדרה גרעינית במכשיר להחדרה גרעינית, והתאים מוסuspendedים מחדש במצע מותנה ב-meth ומודגרים בטמפרטורה של 37 °C. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות מניפולציה גנטית יעילה באמצעות יעילות טרנספקציה גבוהה בתאי iPS אנושיים.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון שיטות טרנספקציה באמצעות אלקטרופורציה והחדרה גרעינית שתוארו בעבר, הוא שניתן להשיג במעבדתנו באופן שגרתי יעילות טרנספקציה גבוהה בתאי IPS אנושיים עם תוצאות עקביות. הפרוטוקולים שלנו מבטיחים גם מוות תאי מינימלי לאחר שינוי גנטי. לפיכך, הפרוטוקולים שלנו מאפשרים יצירה מהירה ובהיקף נרחב של תאי IPS אנושיים טרנסגניים. לפני התאמת תאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים אנושיים לתרביות ללא תאי מאכיל (feeder-free), הכינו צלחות מצופות gelt TRX.בשלב הבא, שטפו את תאי ה-IPCs האנושיים, ששומרו קודם לכן על תאי מאכיל (feeder cells), בנפח של 1 mL של Accutane לבאר, והדגרימו בטמפרטורה של 37 °C למשך דקה אחת ועד שמרבית התאים יתחילו להיפרד. הוסיפו 10 עד 15 כדוריות זכוכית לתאים ונערו בעדינות את הפלטה. לאחר מכן, הוסיפו 2 mL של knockout D-M-E-M-F 12 ובצעו טריטורציה עדינה. העבירו את תרחיף התאים למבחנה לצנטריפוגה בנפח של 10 mL.סובבו את התאים ב-800 RPM למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. שאבו את העל-נוזל, והשאירו את משקע ה-human IPSC שלם. נכו את המבחנה בעדינות כדי לפזר את משקע התאים בעדינות.ריס, השעה את משקע ה-human IPSC בנפח מתאים של STEM pro medium וחלק אותו בין בארות של פלטת gel TRE coated. בהתאם לקצב השכפול, ניתן להעביר human IPCs ביחס פיצול של 1:2 עד 1:6. הנח בזהירות את הפלטה בתוך אינקובטור ב-37 degrees Celsius ו-5% carbon dioxide, וסובב את הפלטה בעדינות כדי להבטיח פיזור אחיד של התאים בין הבארות.יש להאכיל את התאים מדי יום. כאשר התאים מגיעים ל-80% confluence, הם מוכנים להעברה חוזרת לג'ל חדש. באר מצופה ב-Rex, ביחס פיצול של אחת לשתיים של תאים, צריכה להיות בערך ב-40% עד 50% confluence ובמושבות קטנות המפוזרות באופן אחיד על פני הבאר המצופה בג'ל ביום הטרנספקציה, כדי להשיג יעילות טרנספקציה אופטימלית.כדי להתחיל בהליך זה, הכין 100 µL של מצע knockout במבחנה סטרילית בתנאי eend orph בנפח 1.5 mL. הוסף 27 µL של ריאגנט טרנספקציה gene juice, ערבב היטב והדגר בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר מכן, הוסף 4 µg של DNA פלסמיד.בחירת הפלסמיד היא קריטית להשגת יעילות טרנספקציה אופטימלית. הפלסמיד שנעשה בו שימוש כאן מכיל חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר המונח תחת מקדם CAG, وهو מקדם חזק הפעיל באופן תעתוקי בתאי IPC אנושיים. דגרו את המבחנה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.לאחר 15 דקות, הוסף לתאים את תערובת ה-DNA (gene juice) והנח ללוחית להתנפח. סובב את הלוחית במהירות של 1,200 RPM למשך חמש דקות כדי להגביר את המגע של תערובת הטרנספקציה עם ה-IPCs האנושיים בבאר. דגור את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך לילה, עד ליום המחרת.יש לעקוב אחר יעילות הטרנספקציה ביום הפעולה; לפני כן, טפל את תאי ה-IPC האנושיים ב-10 µM של מעכב ROCK למשך שעה אחת לפחות בטמפרטורה של 37 °C. במהלך הטיפול המקדים בתאי ה-IPS CS האנושיים, הכן 82 µL של תמיסת nuclear effector לתאי גזע אנושיים בתוך פרונטה סטרילית של 1.5 mL. הוסף 80 µL.הוסיפו תוסף אחד וערבבו היטב באמצעות פיפטור. דגרו את התמיסה בטמפרטורה של 37 °C למשך חמש דקות. חממו מראש, בתוך המנדף, מצע תגובה מותנה של תאי מאכיל (feeder cell conditioned media) שהוכרתו מראש ו-0.25% trypsin-EDTA לטמפרטורה של 37 °C.סמנו מראש מבחנה קונית סטרילית אחת בנפח 15 milliliter. הסירו בזהירות את המצע מתרבית ה-human IPSC המיועדת להשפעה גרעינית, ושטפו בעדינות את התאים באמצעות phosphate buffered saline. שאבו את ה-PBS והוסיפו trypsin; דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך שלוש דקות.על מנת להשיג התמרה גרעינית מוצלחת, קריטי שלא להשתמש בטריפסין כדי לפרק את התאים לתאים בודדים. במקום זאת, יש לבצע טריטורציה לתאים לקבלת גושים קטנים המורכבים משני עד שלושה תאים. העבירו בעדינות את התאים באמצעות טיפ של פיפט P 1000 לגושים קטנים המורכבים משני עד שלושה תאים.שטפו את תחתית הבאר באמצעות פיפטציה חוזרת כדי לוודא שכל ה-IPCs האנושיים התנתקו לחלוטין. לאחר מכן, העבירו את תרחיף התאים למסורת קונוית רשומת של 15 milliliter. לאחר מכן, הוסיפו תשעה milliliters של מצע גידול לפיברובלסטים עובריים של עכבר.כדי לנטרל את ה-tripsin, סובבו את התאים ב-800 RPM למשך שלוש דקות. שאבו בזהירות את ה-SUP natant תוך השארת משקע התאים שלם. השביו את התאים ב-100 µL של תמיסת effector גרעינית לתאי גזע אנושיים שחוממה מראש.העבירו תאים לתוך ווטה של אפקטור גרעיני באמצעות טיפ פנפיפט של 1 mL. הוסיפו 4 µg של DNA פלסמיד לס 가수ס התאים בתוך הווטה, וערבבו את התאים וה-DNA באמצעות סיבוב עדין. הקישו את הווטה פעמיים על משטח המCהוד.הכנס את ה-vete למחזיק האפקטור הגרעיני של מכשיר האפקטור הגרעיני. בחר בתוכנית B 0 1 6 nuclear effect cells על ידי לחיצה על כפתור x. המילה Okay תוצג כאשר תהליך ההשפעה הגרעינית יסתיים, דבר שלרוב אורך בין שנייה אחת לחמש שניות. השתמש בפיפט הפלסטיק שסופק בערכת האפקטור הגרעיני כדי לשלוף תאים שעברו השפעה גרעינית מה-vete. שחזר את התאים על ידי ריסוף (Resus), השעיה שלהם ב-CM ובמעכב רוק (rock inhibitor) שחוממו מראש בתוך פרוביקט סטרילי בנפח 1.5 milliliter. דגראת את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך 10 דקות.לאחר 10 דקות, השתמש בקצה פפית של מיליליטר אחד כדי להעביר את התאים בטיפות על שכבות המזינות (feeder layers). דגור את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך הלילה. עקוב אחר יעילות הטרנספקציה.מוצגות כאן פוטומקרוגרפיות של תאי RIV one human IPSC המבטאים EGFP, אשר עברו טרנספקציה באמצעות gene juice on gel Rex כ-12 שעות לאחר טרנספקציית הפלסמיד. טרנספקציית DNA של תאי human IPSC באמצעות gene juice עם פרומוטר חזק מניבה בדרך כלל יותר מ-60% תאים המבטאים את הדיווח EGFP במבחן טרנספקציה זמנית.ניתן להשיג תאים המבטאים EGFP גם באמצעות נוקלאופקציה, כפי שמוצג בתמונות אלו של תאי IPCs אנושיים של RIV one שנספחו והתגבשו על תאי מאכיל (feeders) לאחר נוקלאופקציה באמצעות תוכנית הנוקלאופקציה B 0 1 6 או תוכנית הנוקלאופקציה A 0 2 3. שימוש בתוכנית B 0 1 6 מוביל לעד 80% של תאים חיוביים ל-EGFP, בעוד שתוכנית A 0 2 3 הניבה פחות מ-10% תאים חיוביים ל-EGFP. יתרה מכך, ניתן להפיק שיבוטים (clones) יציבים של תאי iPSCs אנושיים טרנסגניים המבטאים את הגן trends.כאן מוצגת דוגמה למושבות של תאי גזע אנושיים מושרוצים (iPSC) המביעים EGFP יציב, עם ביטוי EGFP בכל התאים שנגזר מ-gene juice. תאים אלו שומרים על ביטוי קונסטיטוטיבי של EGFP במהלך התמיינות לגוף עוברי. לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של אופן הטרנספקציה של תאי iPSC אנושיים.מניפולציה גנטית יעילה היא כלי חיוני לחקר היבטים שונים של ביולוגיה של תאי גזע, ותאיץ את השימוש בקווי תאי iPS אנושיים ברפואה רגנרטיבית.

transfecting-and-nucleofecting-human-induced-pluripotent-stem-cells

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

היכרות עם גן עניין לתא היא שיטה חזקה הבהרת תפקידה in vivo. פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה transfecting תרבות של גזע אנושי / מבשר תאים עצביים (hNSPCs) באמצעות מנגנון electroporation Nucleofector שנעשו על ידי Amaxa.

Transfecting אדם בתאי גזע עצביים עם Nucleofector Amaxa

עכבר Stemgent DOX ועין מתנהלת TF הגדר Lentivirus ניתן לתכנת מחדש fibroblasts העכבר עובריים (MEFs) הנגרמת על גזע pluripotent (שב"ס) תאים. כאן אנו מדגימים את פרוטוקול לביטוי DOX-ועין מתנהלת תכנות מחדש של העכבר גורמי תעתוק Oct4, Sox2, Klf4 ו c-myc ליצור מושבות iPS המבטאים משותף סמנים MES pluripotency.

הדור של גזע תאים מושרה pluripotent על ידי תכנות מחדש Fibroblasts עכבר עובריים עם פקטור ארבעה תמלול, דוקסיציקלין ועין מתנהלת מערכת התמרה lentiviral

אנו מדגימים את פרוטוקול עבור הדור של המושרה בתאי גזע pluripotent מן האדם תאים סומטיים באמצעות lentivirus בתיווך המסירה של גורמים אנושיים Oct4, Sox2, Nanog, ו Lin28. Pluripotency אושרה על ידי המורפולוגיה ואת הנוכחות של גזע עובריים (ES) סמנים ספציפיים התא.

הדור של גזע תאים מושרה pluripotent על ידי תכנות מחדש Fibroblasts האדם עם Lentivirus Stemgent TF האדם הגדר

אנו מציגים פרוטוקול תכנות מחדש יעיל של האדם התאים הסומטיים אל האדם המושרה בתאי גזע pluripotent (hiPSC) באמצעות וקטורים retroviral קידוד Oct3 / 4, Sox2, Klf4 ו-c-myc (OSKM) וזיהוי של hiPSC לתכנות מחדש בצורה נכונה על ידי צביעה חיה עם Tra למוצרי 1-81 נוגדנים.

בחירה בידוד מושבות של בתאי גזע pluripotent מושרה לתכנות מחדש של Fibroblasts למבוגרים

שיטה ליצירת אדם המושרה גזע pluripotent תאים (iPSCs) דרך לביטוי רטרווירוס בתיווך חוץ רחמי של OCT4, Sox2, KLF4 ו myc מתואר. באופן מעשי לזיהוי מושבות iPSC אדם המבוססים על ביטוי של GFP נדון גם.

תכנות מחדש האדם תאים סומטיים תוך המושרה בתאי גזע pluripotent (iPSCs) באמצעות וקטור retroviral עם GFP

כאן, אנו מציגים שיטה הוקמה לתכנת מחדש תאים סומטיים אנושיים לiPSCs אדם נטול transgene בוירוס סנדאי, אשר מראה תוצאות עקביות ויעילות משופרת.

תאי גזע יעיל דור מושרה אדם פלוריפוטנטיים מתאים הסומטיים של אדם עם סנדאי וירוס

אנו מתארים פרוטוקול להפקת תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים מתוכנתים מחדש ומאופיינים ללא גורמים והמרה למצבים קליניים משוערים.

גזירה ואפיון ללא transgene האדם המושרה pluripotent גזע קו סלולארי והמרה לתנאי כיתה קלינית מוגדרים

פרוטוקול זה מתאר אינדוקציה יעילה של אנדותל המוגני ואבות המטופויאטיים רב-פוטנציאליים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות ביטוי מאולץ של גורמי שעתוק.

אינדוקציה ישירה של Hemogenic האנדותל ודם על ידי יתר של גורמי שעתוק בתאי גזע pluripotent האדם

כתב יד זה מספק נוהל שלב אחר שלב לגזירה ותחזוקה של קרטינוציטים אנושיים משיער מרוט ויצירת תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים ללא אינטגרציה (hiPSCs) על ידי וקטורים אפיזומליים.

דור של תאי גזע האינטגרציה נטול האדם המושרה pluripotent שימוש קרטינוציטים נגזר שיער

כאן אנו מתארים שיטה מפורטת לעריכת גנים חלקה בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות פלסמיד תורם מבוסס piggyBac ומוטנט ניקאז Cas9. שתי מוטציות נקודתיות הוכנסו לאקסון 8 של לוקוס הגורם הגרעיני הפטוציטים 4 אלפא (HNF4α) בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs).

החדרת מוטציות נקודתיות לתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות עריכת גנום חלקה

למד פרוטוקולים מותאמים לטרנספקציה ונוקלאופקציה בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים מושרים (iPSCs). שיטות אלו מאפשרות מניפולציה גנטית יעילה עם תמותת תאים מינימלית ליצירת קווי תאים טרנסגניים.

Transfecting וNucleofecting תאי גזע אנושיים pluripotent מושרים

גלה סרטונים נוספים