השימוש מלכודת אופטית לחקר מארח הפתוגן אינטראקציות עבור הדמיה דינמי תא חי

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להשתמש בלכידה אופטית בשילוב עם מיקרוסקופיה קונפוקלית של דיסק מסתובב כדי לצפות באינטראקציות של פתוגנים מארחים בזמן אמת. זה מושג על ידי הוספת הפתוגנים המעניינים תחילה לזכוכית כיסוי תא. לאחר מכן, חלקיק נבחר ונלכד עם המלכודת האופטית.

לבסוף, החלקיק מופנה לתא המעניין. כפי שניתן לראות כאן. לכידה אופטית יכולה להיות שיטה יעילה לשליטה בשני חלקיקים לתצפית על אינטראקציות תוך-תאיות דינמיות.

שיטה זו יכולה לענות על שאלות חשובות באינטראקציות של פתוגנים מארחים בתחומי מחלות זיהומיות ואימונולוגיה, כולל מהי ההשפעה על פגוציטוזיס כאשר מתקבלת שליטה מלאה על היחסים המרחביים בין תאי מארח לפתוגנים, כמו גם האם סדר הפתוגנים הנקלטים על ידי תא פגוציטי משפיע על התבגרות פא סומלית. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שתנאי הלכידה צריכים להיות מותאמים לסוגי תאים וחרוזים שונים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית כתהליך ההתקנה והשילוב של דיסק מסתובב.

קשה להמשיג קונפוקלי למלכודת אופטית בשל היישור המדויק הדרוש לכל הרכיבים האופטיים. קצור את הפתוגן המעניין. לדוגמה, כאן, 300 מיקרוליטר של אלביקנים קנדיים שגדלו בן לילה במרק מוסרים מהתרבית ומעבירים את הפתוגנים לצינור תגובה של 1.5 מיליליטר.

לאחר מכן שטפו את הפתוגנים שלוש פעמים בטמפרטורה של כ-1300 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, שאפו את הסופרנטנט והשאירו את הכדור ללא הפרעה בכל פעם שהשהה מחדש PBS וסוניקט. לאחר הכביסה השלישית, יש להשעות את הגלולה ב -500 מיקרוליטר PBS. לאחר מכן, ממיסים מיליגרם אחד של צבע ההפקדה ב -100 מיקרוליטר דימתילפורממיד לריכוז סופי של 10 מיליגרם למיליליטר.

לאחר מכן הוסף שלושה מיקרוליטרים מתערובת הצבע לצינור התגובה המכיל את הפתוגנים השטופים. הניחו נייר כסף סביב הצינורות מכיוון שהצבעים רגישים לאור ונערו את הדגימה ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה, ולאחר מכן גלולו ושטפו את הדגימה ב-PB S3 פעמים כמו קודם. השעו מחדש את הגלולה ב -300 מיקרוליטר PBS לאחר הכביסה האחרונה.

מדיה חמה מנסה ו-PVS עד 37 מעלות צלזיוס באמבט מים לשטוף. צלחת תרבית רקמה בגודל 10 סנטימטר מצופה במקרופאגים גולמיים 2 6 4 0.7 פעמיים עם PBS השואב את ה- PBS בין כל שטיפה. לאחר מכן, מכסים את משטח הצלחת בחמישה מיליליטר טריפסין ודוגרים את הצלחת למשך חמש דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן דפקו בעדינות את צד הצלחת כדי לנתק את התאים משטח הצלחת. היזהר לא להתיז את הטריפסין מחוץ לצלחת. כעת הוסיפו לצלחת חמישה מיליליטר מדיה והעבירו את התערובת לצינור תגובה.

לאחר הגלולה, התאים שואבים את המדיה תוך הקפדה לא להפריע לגלולה ולהשעות מחדש את הגלולה ב-10 מיליליטר מדיה. הוסף 400 מיקרוליטר של מדיה לכל תא של מגלשת תא, ולאחר מכן הוסף חמישה מיקרוליטר של מתלה התא לכל תא. אפשרו לתאים לגדול בן לילה באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.

אחזר את שקופית החדר מפיפטה החממה חמישה עד 10 מיקרוליטר של פתוגנים מעניינים שהוכנו בעבר עם תווית פלואורסצנטית לכל תא של מקרופאגים. מערבבים היטב את המקרופאגים והפתוגנים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה, תוך הקפדה לא לגעת בתחתית החדר ולהפריע למקרופאגים הדבוקים. הפעל את כל מרכיבי המיקרוסקופ הקונפוקלי של הדיסק המסתובב.

הכן את המיקרוסקופ על ידי הוספת שמן לעדשת האובייקט של טבילת השמן. הכנס את שקופית החדר לתוך השלב המיוחד ולאחר מכן הסר את החלק העליון של מיקרוסקופ יישור שקופיות החדר להדמיית DIC. הפעל את התריס עבור המלכודת האופטית ולייזר ה-IR.

לאחר מכן פתח את התריס בלייזר למלכודת האופטית. ודא שהתריס מול לייזר ה-IR סגור על ידי בדיקה עם כרטיס ה-IR. כעת התמקדו במקרופאגים בשקופית המודבקת.

לאחר מכן מצא את הפתוגנים צפים בחופשיות בתמיסה הסמוכה למקרופאגים. החלק הקשה ביותר בהליך זה הוא מציאת האובייקט הנכון למעקב בתא הדגימה עקב כוחות ההדבקה בין האובייקט לזכוכית הכיסוי בתא הדגימה. על מנת להזיז את האובייקט הזה, עליך להזיז את הבמה בזמן שהאובייקט מוחזק על ידי לייזר התנועה, וחשוב גם לציין שעליך להזיז את הבמה במיקום איטי מספיק כך שכוח הגרר של השלב לא יעלה על כוח הלכידה המקסימלי על ידי המלכודת.

הזיזו את השלב כך שהפתוגן יהיה בקרבת המלכודת. לאחר מכן פתח את התריס והפעל את המלכודת. הזיזו את הדגימה כדי להביא את המקרופאגים למגע עם תמונת פתוגן לכוד נייחת.

הפתוגנים עם מיקרוסקופ קונפוקלי דיסק מסתובב בפלואורסצנטיות DIC או שילוב של שתי אוכלוסיות נפרדות של אלביקנים קנדיים, שגודלם בדרך כלל כחמישה מיקרון, סומנו בירוק, כחול ואדום. כדי להמחיש את ההדמיה, אלביקן C בודד נלכד והועבר בתבנית מרובעת דרך מקבץ של שמרים אחרים כפי שמצוין על ידי החצים האפורים, מה שמדגים את היכולת ללכוד ולתפעל את המיקום הספציפי של פתוגן בודד שנבחר על ידי המפעיל גם בסביבה צפופה. כדי להמחיש עוד יותר את הגמישות של מערכת זו ללכוד את מורפולוגיות הצורות השונות המוצגות על ידי אורגניזמים פתוגניים באיור זה, נעשה שימוש בפינצטה האופטית כדי להחזיק ולמקם חלקיק C albicans עם פסאודו היפי.

ה-C albicans מסומן בצבע אדום ומועבר לאורך מסלול כפי שמתואר על ידי החץ הלבן וממוקם ליד תאים גולמיים פלואורסצנטיים GFPL C3. בירוק. חלק השמרים של האלביקנים נלכד כשהפסאודו היפי נגרר אחריו.

האלה Aspergillus fum הוצבה גם ליד תא מקרופאג של עכבר גולמי על מנת לנתח את מסגרת הזמן המוחלטת של פגוציטוזיס עם קו התאים והפתוגן הספציפי הזה. באיור זה, תמונות שדה בהיר מראות כיצד האספרגילוס הלכוד, כפי שמצוין על ידי החץ הלבן, הועבר והוצב לאורך הנתיב כפי שמצוין על ידי החץ האדום. הפתוגן הכלוא נמצא מעט מחוץ למיקוד בגלל המלכודת שדוחפת את האורגניזם מעט מעל מישור המוקד.

אספרגילוס הועבר עד שהונח בסמוך לתא הגולמי הרצוי. ברגע שהפתוגן יצר מגע עם התא, המלכודת כובתה. תהליך הפגוציטוזיס הופעל ונעשה שימוש בהדמיית זמן-lapse כדי לצפות באירועים התאיים הבאים.

לאחר 30 שניות, הממברנה של התא הגולמי החלה להשתנות וליצור סביב החלקיק. לאחר 60 שניות, הכוס נוצרה במלואה. מ-90 שניות ל-150 שניות, ה-Afu Gotti הפך ונבלע, וב-180 שניות החלקיק הופנם במלואו.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור מכשיר מלכודת אופטית של דיסק מסתובב, וכיצד מכשיר כזה יכול לאפשר לשלוט באופן לא פולשני בפתוגנים להדמיית תאים חיים לאחר פיתוחו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום האינטראקציות בין פתוגנים מארחים לחקור את תפקידם של יחסים מרחביים בין תאים מארחים לפתוגנים, ואת תפקידם על התגובה החיסונית הנובעת מכך.