בידוד חלבונים תוך-תאיים ותוך-תאיים מתרבית אסטרוציטים

קח תרבית אסטרוציטים והסר את המדיום. הוסף חיץ פיזיולוגי ודגר על קרח, ומעכב אנדוציטוזיס של חלבונים על פני התא.

דגירה עם מגיב ביוטינילציה הקושר את חלבוני פני התא.

לאחר מכן, דגרו עם מאגר מרווה כדי להשבית כל מגיב שלא הגיב.

הוסף חיץ פיזיולוגי קר ונתק מכנית את התאים. העבירו את התאים, ואז צנטריפוגה והשליכו את הסופרנטנט.

דגירה עם מאגר ליזה כדי ליז את התאים, לשחרר חלבונים תוך-תאיים ביוטיניליים וחלבונים תוך-תאיים שאינם ביוטיניליים.

צנטריפוגה, אוספים את הסופרנטנט ומפרידים חלק עם תכולת החלבון הכוללת.

דגרו את החלק הנותר בתסיסה עם חרוזים מצופים סטרפטווידין הקושרים חלבונים ביוטיניים.

סובבו את החרוזים הקשורים לחלבון על פני התא והפרידו את הסופרנטנט המכיל חלבונים תוך-תאיים.

שטפו את החרוזים תחת תסיסה כדי להסיר חלבונים שאינם קשורים במיוחד, ואז צנטריפוגה והשליכו את הסופרנטנט, תוך בידוד החלבונים על פני התא.

השברים המכילים חלבונים כוללים, תוך-תאיים וחלבונים על פני התא מוכנים לניתוח.

כדי להתחיל בהליך זה, הסר את תרביות האסטרוציטים מהחממה והשליך את המדיום על ידי שאיפה. שוטפים את התאים שלוש פעמים עם 4 מיליליטר CM-PBS צונן, ומניחים את הכלים על קרח כתוש.

הסר את ה-CM-PBS על ידי שאיפה, ולאחר מכן, פיפטה שני מיליליטר של מאגר ביוטין לכל באר. הטו בעדינות את הכלים קדימה ואחורה כמה פעמים, כדי להבטיח כיסוי מלא לפני הנחת