בידוד חלבונים תוך-תאיים ותוך-תאיים מתרבית אסטרוציטים

קח תרבית אסטרוציטים והסר את המדיום. הוסף חיץ פיזיולוגי ודגר על קרח, ומעכב אנדוציטוזיס של חלבונים על פני התא.

דגירה עם מגיב ביוטינילציה הקושר את חלבוני פני התא.

לאחר מכן, דגרו עם מאגר מרווה כדי להשבית כל מגיב שלא הגיב.

הוסף חיץ פיזיולוגי קר ונתק מכנית את התאים. העבירו את התאים, ואז צנטריפוגה והשליכו את הסופרנטנט.

דגירה עם מאגר ליזה כדי ליז את התאים, לשחרר חלבונים תוך-תאיים ביוטיניליים וחלבונים תוך-תאיים שאינם ביוטיניליים.

צנטריפוגה, אוספים את הסופרנטנט ומפרידים חלק עם תכולת החלבון הכוללת.

דגרו את החלק הנותר בתסיסה עם חרוזים מצופים סטרפטווידין הקושרים חלבונים ביוטיניים.

סובבו את החרוזים הקשורים לחלבון על פני התא והפרידו את הסופרנטנט המכיל חלבונים תוך-תאיים.

שטפו את החרוזים תחת תסיסה כדי להסיר חלבונים שאינם קשורים במיוחד, ואז צנטריפוגה והשליכו את הסופרנטנט, תוך בידוד החלבונים על פני התא.

השברים המכילים חלבונים כוללים, תוך-תאיים וחלבונים על פני התא מוכנים לניתוח.

כדי להתחיל בהליך זה, הסר את תרביות האסטרוציטים מהחממה והשליך את המדיום על ידי שאיפה. שוטפים את התאים שלוש פעמים עם 4 מיליליטר CM-PBS צונן, ומניחים את הכלים על קרח כתוש.

הסר את ה-CM-PBS על ידי שאיפה, ולאחר מכן, פיפטה שני מיליליטר של מאגר ביוטין לכל באר. הטו בעדינות את הכלים קדימה ואחורה כמה פעמים, כדי להבטיח כיסוי מלא לפני הנחת התרביות על קרח למשך 30 דקות.

לאחר מכן, הסר את מאגר הביוטין, החלף אותו בארבעה מיליליטר של מאגר מרווה, ושמור את התרביות על קרח למשך 10 דקות. לאחר מכן, שאפו והחליפו באותה כמות של מאגר המרווה לפני השארת התרביות על קרח למשך 10 דקות.

לאחר מכן, השליכו את מאגר המרווה ושטפו את התאים שלוש פעמים עם 4 מיליליטר CM-PBS צונן. לאחר מכן, מגרדים את התאים למיליליטר אחד של CM-PBS מקורר ומעבירים את המתלה לצינור מיקרו-צנטריפוגה.

לאחר מכן, גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב -100 גרם למשך שלוש דקות במיקרוצנטריפוגה מקוררת המוגדרת ל -4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים ב-500 מיקרוליטר של מאגר ליזה.

לאחר מכן, השאירו את הדגימות על הקרח למשך 30 דקות, תוך מערבולת כל חמש דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה את הליזאט ב-14,000 גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי לגלול כל חומר ניקוי וחומרים מסיסים. לאחר מכן, העבירו את הסופרנטנט לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה חדש. חסוך 50 מיקרוליטר מהליזאט והוסף אליו 25 מיקרוליטר של מאגר טעינה פי 3.

לאחר מכן, יש לפגוע בו על ידי חימום בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס באמבטיה יבשה. זהו חלק הקלט המכיל גם חלבוני פני תא ביוטיניליים, כמו גם חלבונים ציטוזוליים שאינם ביוטיניליים. בעזרת קצה פיפטה חתוך, העבירו 75 מיקרוליטר של חרוזי אגרוז סטרפטווידין לליזאט, ודגרו אותו בחום של 4 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות על שייקר.

לאחר מכן, גלולה את חרוזי הסטרפטווידין אגרוז על ידי צנטריפוגה ב -1,500 גרם למשך 30 שניות בארבע מעלות צלזיוס. חסוך 50 מיקרוליטר של הסופרנטנט, והוסף 25 מיקרוליטר של מאגר טעינה פי 3. לאחר מכן, דנטורציה בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס באמבט מים או בבלוק חימום. זה מייצג את החלק התוך תאי ומורכב בעיקר מחלבונים ציטוזוליים שאינם ביוטיניליים.

לאחר מכן, השעו מחדש את החרוזים הגלולים במיליליטר אחד של מאגר כביסה, ונדנדו אותו במשך שלוש דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. גלו את החרוזים, והשליכו את הסופרנטנט. חזור על תהליך זה ארבע פעמים נוספות כדי למזער את הקישור הלא ספציפי של חלבונים ציטוזוליים שאינם ביוטיניליים.

הוסף 50 מיקרוליטר של מאגר טעינה מדולל ל-1x באמצעות מאגר ליזה. שחררו ביוטין וסטרפטווידין מהחרוזים על ידי דנטורציה שלהם ב-95 מעלות צלזיוס. חלק זה צריך להכיל חלבוני פני תא ביוטיניליים בלבד.