הערכת פעילות מושכת או דוחה של חלבונים באמצעות נוירונים בהיפוקמפוס

התחל עם צלחת המכילה מטריצת סיליקון בעלת מספר ערוצים קטנים המחוברים ליציאות כניסה ויציאה.

הזריק לחלבון הבדיקה פעילות דוחה דרך הכניסה כדי למלא את התעלות.

דגירה כדי לאפשר היצמדות חלבון באזור התעלה, יצירת אזורי חלבון בדיקה ולאחר מכן שטוף.

הסר את המטריצה, כסה את האזור המצופה בחלבון בקרה בעל פעילות אטרקטיבית, ודגר.

זה מקל על היצמדות חלבון הבקרה לאזורים הריקים בין אזורי חלבון הבדיקה, ויוצר אזורי חלבון בקרה עם דפוס פסים מתחלף, ולאחר מכן לשטוף.

מוסיפים למינין לציפוי אזור הפסים ואז שוטפים.

זרעו את האזור המצופה בהשעיה חד-תאית של נוירונים בהיפוקמפוס ודגרו.

באזור חלבון הבדיקה, הנוירונים מקיימים אינטראקציה עם החלבונים, ומפעילים אותות הגורמים לתאי העצב להדוף, ומעכבים את התקשרותם.

לעומת זאת, אינטראקציות עצב-חלבון באזור חלבון הבקרה מקדמות התקשרות עצבית, ותומכות בצמיחה ובהרחבת האקסון שלהם.

הכן את החלבונים הרקומביננטיים המסומנים בפלואורסצנט ב- PBS. הכינו 25 מיקרוליטר לכל צלחת פסים. נותנים לתערובת לדגור בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן, עבור כל מנה, טען מזרק בגודל 22 עם 25 מיקרוליטר חלבון מדולל והזריק אותו דרך החור הקטן בצד המטריצה.

הימנע מהזרקת בועות אוויר למטריצות מכיוון שהן יפריעו לקשירת החלבונים שלך למחלה.

כעת, דגרו את הכלים למשך 30 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס בחממת תרביות תאים. לאחר הדגירה, הפקידו 300 מיקרוליטר PBS בחריץ העליון של כל מטריצה. לאחר מכן, שאפו את ה-PBS מחור קטן הממוקם בצד של כל מטריצה כדי להסיר את כל החלבונים הרקומביננטיים הלא מחוברים. אין לשאוב את ה-PBS במלואו מכיוון שהחלבונים יתייבשו.

בצע שטיפת PBS זו בסך הכל שלוש פעמים. לאחר מכן, הסר בזהירות את המטריצה מכל מנה. לאחר מכן, הוסיפו מיד כ-100 מיקרוליטר חלבון בקרה על כל אזור הפסים, וצרו ציפוי חלופי על כל מנה.

לאחר מכן, דגרו את הכלים למשך 30 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס. בינתיים, על קרח, הפשירו למינין ב-PBS ב-20 מיקרוגרם למיליליטר. לאחר 30 דקות יש לשטוף את הכלים שלוש פעמים עם PBS. לאחר מכן, מצפים כל מנה בכ -100 מיקרוליטר למינין קר ומחזירים את הכלים לחממה למשך שעה נוספת.

שעה לאחר מכן, השתמש ב-PBS כדי לשטוף את הכלים שלוש פעמים שוב. לאחר הכביסה השלישית מוסיפים כ -150 מיקרוליטר מדיום תרבות לכל מנה. לאחר מכן, דגרו את הכלים באינקובטור של 5% פחמן דו חמצני בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד לפעם הבאה שהם נחוצים. ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר והפעילו 10,000 נוירונים ב-150 מיקרוליטר של מצע תרבית על כל צלחת פסים מוכנה. הפקידו בזהירות את המתלה כדי לכסות את כל אזור הפסים.