בידוד סיבי עמילואיד מתמצית רקמת המוח

קחו תמצית רקמת מוח של עכבר המכילה חלבונים שאינם עמילואידים וסיבי עמילואיד, אגרגט חלבון בלתי מסיס.

מוסיפים סוכרוז מוצק ומערבבים, ומגדילים את צפיפות התמיסה.

העבירו אותו וצנטריפוגה כדי להפריד חלבונים צפופים יותר מפסולת.

השליכו את הסופרנטנט, השעו מחדש את הגלולה במאגר ריכוז סוכרוז גבוה יותר, ערבבו וצנטריפוגה.

אוספים את השכבה העליונה המכילה כמה סיבי עמילואיד בשפופרת טרייה, מוסיפים חוצץ כביסה ומערבבים.

כעת, השליכו את השכבה האמצעית והעבירו את הגלולה המועשרת בסיבי עמילואיד לצינור המכיל את חלק השכבה העליונה לבידוד מקסימלי.

צנטריפוגה את השברים המשולבים והשליכו את הסופרנטנט. הוסיפו חוצץ עיכול ודגרו כדי לפרק חלבונים שאינם עמילואידים באופן בלעדי.

צנטריפוגה והסר את הסופרנטנט. שטפו את הגלולה כדי להסיר שאריות חלבונים מעוכלים.

השעו מחדש את הגלולה במאגר מסיס על בסיס סוכרוז המכיל חומר ניקוי הממיס את החלבונים הנותרים שאינם עמילואידים.

צנטריפוגה, הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את סיבי העמילואיד המבודדים.

התחל בהנחת אזור רקמת מוח שזה עתה נותח או הוקפא בצינור של שני מיליליטר המכיל שישה עד שמונה חרוזי קרמיקה ומאגר הומוגניזציה קר כקרח. לאחר מכן, טוחנים את הרקמה באמצעות הומוגנייזר טחנת חרוזים ב-4,000 סל"ד, עם שני מחזורים של 30 שניות דופק הפעלה וכיבוי. כעת, הוסיפו תשעה מיליליטר של חוצץ הומוגניזציה קר כקרח למיליליטר אחד של רקמת מוח הומוגנאט בשפופרת של 15 מיליליטר, ואטמו עם רצועות סרט שעווה במעבדה.

כדי להבטיח מסיסות חזקה, השאר את הצינור מסתובב למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס. למחרת, הוסף סוכרוז מוצק לתרחיף תמצית הרקמה לריכוז סופי של 1.2 שומות. מערבבים היטב וצנטריפוגה בחום של 250,000 פעמים גרם למשך 45 דקות בחום של 4 מעלות צלזיוס. לאחר השלכת הסופרנטנט, השעו מחדש את הגלולה בשני מיליליטר של מאגר הומוגניזציה המכיל 1.9 סוכרוז מולארי על ידי טריטורציה וצנטריפוגה ב-125,000 פעמים גרם למשך 45 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.

לאחר הצנטריפוגה, העבירו את השכבה המוצקה הלבנה העליונה לצינור טרי, והמיסו ב-1 מיליליטר של מאגר כביסה קר כקרח על ידי פיפטינג למעלה ולמטה מספר פעמים. מכיוון שהגלולה מועשרת גם בסיבי עמילואיד, השליכו את השכבה האמצעית המימית ושלבו את הגלולה עם השכבה העליונה לתשואה גבוהה יותר. צנטריפוגה את השברים המשולבים ב-8,000 פעמים גרם למשך 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.

לאחר השלכת הסופרנטנט, השעו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של מאגר עיכול קר כקרח, ודגרו בטמפרטורת החדר למשך שלוש שעות על מערבולת. צנטריפוגה את הדגימה שוב, לאחר מכן, שטפו את הכדור פעמיים ב-1 מיליליטר של מאגר טריס קר כקרח, ושוב צנטריפוגה. לאחר הכביסה השנייה, השעו מחדש את הגלולה ב-1 מיליליטר של מאגר מסיס על ידי צנרת למעלה ולמטה, וצנטריפוגה מהירה של הצינור ב-200,000 פעמים גרם למשך 60 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.

שמור את הגלולה, לאחר מכן, הפחת את ריכוז הסוכרוז מ-1.3 ל-1 טוחנת על ידי הוספת 50 מילי-מולרי טריס בופר לסופרנטנט. צנטריפוגה הסופרנטנט שוב, אם כן, ממיסה את שני הכדורים ב-100 מיקרוליטר של מאגר טריס המכיל 0.5% SDS. לטיהור עמילואיד, יש להמיס את הכדורים העשירים בעמילואיד באמצעות גלי אולטרסאונד במכשיר סוניקציה לאמבטיה למשך 20 מחזורים. לאחר מכן, צנטריפוגה מיד את החומר ב -20,000 פעמים גרם למשך 30 דקות ב -4 מעלות צלזיוס.

השעו מחדש את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של 0.5% SDS Tris buffer, וחזרו על הכביסה ארבע פעמים נוספות. לאחר שלב הצנטריפוגה האחרון, שטפו את הגלולה ב -200 מיקרוליטר מים טהורים במיוחד, וצנטריפוגה ב -20,000 פעמים גרם למשך 30 דקות ב -4 מעלות צלזיוס כדי להסיר את כל חומר הניקוי שנותר. ממיסים את הגלולה הסופית המכילה סיבי עמילואיד מטוהרים ב-100 מיקרוליטר מים טהורים במיוחד.