הערכת הכדאיות העצבית בתרבית נוירונים במוח הקטן באמצעות צביעה כפולה

התחל עם צלחת תרבית שטופלה בחומר אנטי-מיטוטי המעכב את צמיחת תאי הגליה, ומשאיר בעיקר נוירונים של גרגירי המוח הקטן ומספר קטן של תאי גליה.

הסר את המדיום והוסף לאט לאט מי מלח קרים עם פוספט או PBS כדי לשמור על כדאיות התא.

החלף את המאגר בתערובת מכתים קרה ודגירה.

תערובת זו מכילה פלואורסצאין דיאצטט או FDA, תרכובת שאינה פלואורסצנטית, ופרופידיום יודיד או PI, צבע פלואורסצנטי אטום לממברנה.

ה-FDA מתפזר לתאים, שם האסטראז הפונקציונלי בתאים חיים הופך אותו לתרכובת פלואורסצנטית ירוקה.

PI נכנס לתאים מתים דרך ממברנות פגועות, נקשר ל-DNA ופולט פלואורסצנטיות אדומה.

הסר את תמיסת הצביעה והוסף PBS קר כדי למנוע התייבשות של התאים.

השג תמונות פלואורסצנטיות עבור כתמי FDA ו-PI ותמונת ניגודיות פאזה. מיזוג תמונות ה-FDA וה-PI.

לאחר מכן השווה את תמונת הקרינה הזו עם תמונת ניגודיות הפאזה, שעוזרת להוציא את תאי הגליה הגדולים.

פלואורסצנציה אדומה מצביעה על מוות עצבי, ואילו פלואורסצנציה ירוקה מסמלת כדאיות עצבית.

התחל את הצביעה על ידי ערבוב פלואורסצאין דיאצטט לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם למיליליטר ופרופידיום יודיד לריכוז סופי של 50 מיקרוגרם למיליליטר ב-10 מיליליטר PBS. מערבבים את תמיסת ה-FDA PI על ידי מערבולת ומניחים על קרח. הניחו את צלחת התרבות על קרח.

שאפו בזהירות את מדיום התרבות מבלי לגעת בתאים עם קצה הפיפטה. לאחר מכן, הוסיפו לאט PBS קר. שאפו את ה-PBS, ולאחר מכן הוסיפו פתרון עבודה קר של FDA PI או FDA PI Hoechst. שים את הצלחת על קרח למשך חמש דקות. לאחר מכן, לאחר שאיבת פתרון העבודה של ה-FDA PI או ה-FDA PI Hoechst, הוסף PBS קר לכל באר.

ודא שהמיקרוסקופ הפלואורסצנטי מוגדר כהלכה. זהה את פליטות הקרינה עבור FDA PI ו-Hoechst ב-520, 620 ו-460 ננומטר, בהתאמה, באמצעות זמן חשיפה בין 100 ל-300 אלפיות השנייה ורווח אנלוגי של פי 2.8. לאחר איסוף תמונות פלואורסצנטיות, צלם תמונה באור רגיל באמצעות מצב ניגודיות פאזה.

לצביעה כפולה של ה-FDA PI, שכב את תמונות התאים על ידי גרירת השכבה החיובית של ה-FDA על גבי השכבה החיובית של PI בתוכנת עריכה גרפית. התאימו את האטימות של השכבה החיובית ל-FDA באמצעות הזנת 50% בשדה האטימות של החלונית 'שכבות'. מיזוג שתי שכבות על ידי פתיחת השכבה בתפריט ולחיצה על מיזוג גלוי לחצן. הגדר את הניגודיות של התמונות המונחות על ידי הזנת 50 בשדה הניגודיות תחת תמונה, התאמות, בהירות/ניגודיות. בדוק שאין תאים חיוביים כפולים של ה-FDA וה-PI בתמונות השכבה.

עבור צביעה משולשת של ה-FDA PI Hoechst, שכב את תמונות התאים על ידי, שוב, גרירת השכבה החיובית ל-FDA על השכבה החיובית ל-PI, התאמת האטימות של השכבה החיובית ל-FDA ומיזוג התמונות כמו קודם. לאחר מכן, גרור את השכבה החיובית של Hoechst על השכבה הממוזגת.

התאם את האטימות של השכבה החיובית של Hoechst על-ידי הזנת 50% בשדה האטימות של החלונית Layers, ומזג את שתי השכבות על-ידי פתיחת התפריט Layer ולחיצה על הלחצן Merge Visible. הבחין חזותית בין תאי גליה גדולים ולא סדירים לבין נוירונים גרגיריים במוח הקטן על ידי השוואת התמונות שצולמו במצב פלואורסצנטי לאלו שצולמו במצב ניגודיות פאזה.