הערכת הכדאיות העצבית בתרבית נוירונים במוח הקטן באמצעות צביעה כפולה

התחל עם צלחת תרבית שטופלה בחומר אנטי-מיטוטי המעכב את צמיחת תאי הגליה, ומשאיר בעיקר נוירונים של גרגירי המוח הקטן ומספר קטן של תאי גליה.

הסר את המדיום והוסף לאט לאט מי מלח קרים עם פוספט או PBS כדי לשמור על כדאיות התא.

החלף את המאגר בתערובת מכתים קרה ודגירה.

תערובת זו מכילה פלואורסצאין דיאצטט או FDA, תרכובת שאינה פלואורסצנטית, ופרופידיום יודיד או PI, צבע פלואורסצנטי אטום לממברנה.

ה-FDA מתפזר לתאים, שם האסטראז הפונקציונלי בתאים חיים הופך אותו לתרכובת פלואורסצנטית ירוקה.

PI נכנס לתאים מתים דרך ממברנות פגועות, נקשר ל-DNA ופולט פלואורסצנטיות אדומה.

הסר את תמיסת הצביעה והוסף PBS קר כדי למנוע התייבשות של התאים.

השג תמונות פלואורסצנטיות עבור כתמי FDA ו-PI ותמונת ניגודיות פאזה. מיזוג תמונות ה-FDA וה-PI.

לאחר מכן השווה את תמונת הקרינה הזו עם תמונת ניגודיות הפאזה, שעוזרת להוציא את תאי הגליה הגדולים.

פלואורסצנציה אדומה מצביעה על מוות עצבי, ואילו פלואורסצנציה ירוקה מסמלת כדאיות עצבית.

התחל את הצביעה על ידי ערבוב פלואורסצאין דיאצטט לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם למיליליטר ופרופידיום יודיד לריכוז סופי של 50 מיקרוגרם למיליליטר ב-10 מיליליטר PBS. מערבבים את תמיסת ה-FDA PI על ידי מערבולת ומניחים על קרח. הניחו את צלחת התרבות על קרח.

שאפו בזהירות את מדיום התרבות מבלי לגעת בתאים עם קצה הפיפטה. לאחר מכן, הוסי