הדמיה של תאי עצב בגוף פטריות במוחות דרוזופילה באמצעות צביעת מערכת החיסון

הניחו מוחות דרוזופילה מסוג בר ומוטנטי בתמיסה המכילה מקבע וחומר ניקוי. דגירה עם נדנדה עדינה.

הקיבוע שומר על מורפולוגיה של הרקמות, ואילו חומר הניקוי מחלחל לקרומי התאים.

אפשרו למוח להתייצב, ואז הסירו את התמיסה.

שוטפים את הטישו עם חיץ.

הוסף תמיסת חסימה כדי למנוע קשירת נוגדנים לא ספציפיים.

הסר את התמיסה והוסף נוגדנים ראשוניים המכוונים לחלבון ספציפי המווסת את ההתפתחות האקסונלית בגוף הפטרייה של המוח, או MB, נוירונים.

דגירה כדי לקדם קשירת נוגדנים.

יש לשטוף עם חוצץ כדי להסיר נוגדנים לא קשורים.

דגירה עם נוגדנים משניים מצומדים פלואורופור המכוונים לנוגדנים הראשוניים.

שטפו שוב כדי להסיר נוגדנים לא קשורים, ואז השעו מחדש את המוח במדיום הרכבה.

הרכיבו את המוחות על מגלשת גשר ודמיינו אותם תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

בהשוואה לסוג הפראי, המוחות המוטנטיים מציגים פנוטיפ פגום, עם הקרנות שגויות אקסונליות ואונות MB חסרות.

תחת המיקרוסקופ, השתמש בפיפטה P200 כדי להעביר 10 עד 15 מוחות מנותחים באותו גנוטיפ לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה של 0.5 מיליליטר מלא ב-4% פרפורמלדהיד מדולל ב-PTN. לאחר מכן, דגרו על המוחות למשך 20 דקות עם נדנוד איטי בטמפרטורת החדר. לאחר הקיבוע, אפשרו למוח להתיישב בתחתית הצינור, ואז הסירו את הקיבוע.

לאחר מכן, בצע שתי כביסות מהירות עם 500 מיקרוליטר PTN לכל כביסה. החלף את ה-PTN ברגע שהמוח מתיישב בצינור. לאחר מכן, בצע שלוש כביסות ארוכות עם PTN באמצעות תסיסה עדינה בטמפרטורת החדר.

לאחר שטיפות אלה, המוחות עשויים להיות מאוחסנים למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס ב-PTN. לאחר הסרת שטיפת ה- PTN האחרונה, דגרו את המוח ב 0.5 מיליליטר של תמיסת חסימה למשך 30 דקות לפחות בטמפרטורת החדר, ובתסיסה עדינה. לאחר הסרת התמיסה החוסמת, יש להוסיף את הנוגדנים הראשוניים המדוללים בתמיסת החסימה, ולדגור על המוח ב-4 מעלות צלזיוס למשך יומיים בערבול עדין.

הסר את הנוגדן העיקרי באמצעות גדוד הכביסה PTN בן 5 שטיפות ולאחר מכן החל את הנוגדנים המשניים. אפשר לנוגדנים אלה לדגור עם הרקמות במשך שלוש שעות בטמפרטורת החדר כשהם מוגנים מאור עם נדנדה.

לאחר דגירה של מוחות בתמיסת הנוגדנים המשנית, יש למרוח את גדוד הכביסה PTN, לכסות את הדגימות בנייר כסף לאחר כל שטיפה, ולסיים בהסרת כמה שיותר מאגר. לאחר מכן, הוסף 75 מיקרוליטר של מדיום הרכבה פלואורסצנטי נגד דהייה והזרם את המוח והמדיום פנימה והחוצה מקצה הפיפטה פעם אחת בלבד. לאחר מכן ניתן לעטוף את הצינור בנייר כסף ולאחסן אותו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך מספר ימים, אך באופן אידיאלי, המשך ישירות בהרכבה.

כדי להרכיב את המוח, בנה מגלשת גשר. מקם שני כיסויי בסיס במרחק של כסנטימטר אחד זה מזה על מגלשה טעונה חיובית. ודא שהמגלשה הטעונה חיובית פונה כלפי מעלה. לאחר מכן, הדביקו את הכיסויים לשקופית בעזרת לק אצבע, ותנו ללק להתייבש לחלוטין לפני שתמשיכו.

לאחר מכן, הנח את השקופית מתחת לסטריאומיקרוסקופ, והכניס מוחות פיפטה ומדיום לתוך הרווח שבין הכיסויים. הקפד להתאים את התאורה כדי לשפר את ההדמיה של המוח.

לאחר מכן, שאפו את אמצעי ההרכבה הנוספים מהמגלשה והקפידו להימנע מהמוח. לאחר מכן, נדפו את אמצעי ההרכבה העודפים שנותרו. זה יאפשר למקם את המוחות בצורה מדויקת יותר.

כעת, באמצעות מלקחיים, כוונו את המוחות לתבנית רשת כאשר אונות האנטנות שלהם פונות כלפי מעלה. לאחר מכן, הניחו כיסוי על המוח, והשתמשו בלק אצבע כדי לאטום את הקצוות של הכיסוי העליון המחוברים לכיסויי הבסיס. כעת, טען את החלל המרכזי באמצעי הרכבה טריים בכיוון טיפתי, מה שמאפשר למשוך את המדיה מתחת לכיסוי על ידי פעולה נימית. כאשר החלל מתמלא, אטום אותו לחלוטין באמצעות לק אצבע שקוף.