קביעת רעילות הנגרמת על ידי ננו-חלקיקים בתאי עצב באמצעות מיקרוגליה כביו-חיישן חלופי

קח תרביות מיקרוגליה בצלחת מרובת בארות המכילה מדיה.

החלף מחצית מהמדיה בבאר הבדיקה במדיה המכילה ננו-חלקיקי כסף, ובבאר הבקרה במדיה של הרכב. דגירה.

המיקרוגליה מפנימה את הננו-חלקיקים, מופעלת ומשחררת ציטוקינים פרו-דלקתיים.

העבר את מדיית הרכב ואת המדיה הממוזגת המכילה ציטוקינים אלה למסננים המותקנים על צינורות איסוף.

צנטריפוגה להסרת הננו-חלקיקים, תוך שמירה על הציטוקינים.

הפוך את המסננים לצינורות איסוף חדשים, צנטריפוגה ואסוף את המדיה. הוסף מדיה חדשה.

לאחר מכן, קחו תרביות עצביות היפותלמוסיות.

החלף מחצית ממדיית באר הבקרה במדיית הרכב ואת מדיית באר הבדיקה במדיה ממוזגת. דגירה.

הציטוקינים נקשרים לקולטנים על נוירונים היפותלמוסיים, ומפעילים מסלולי איתות הגורמים למוות עצבי.

מוסיפים רזזורין ומדגרים.

בתאים חיים, אנזימי דהידרוגנאז מפחיתים את הרזזורין הפלואורסצנטי החלש לרסורופינה פלואורסצנטית.

מדוד את הקרינה.

פלואורסצנטיות מופחתת מצביעה על מוות עצבי מוגבר בהיפותלמוס, מה שמרמז על רעילות עצבית הנגרמת על ידי ננו-חלקיקים.

כדי להתחיל, אספו 200 מיקרוליטר של מדיום סופרנטנט מכל צלחת היטב, והעמיסו אותו על מסנן שיסיר את הננו-חלקיקים, המונחים על צינור מיקרו-צנטריפוגה.

חשוב לזכור שבעת סינון הננו-חלקיקים, גודלם, צורתם וריכוזם ישפיעו על יעילות הסינון, ולכן רצוי לבדוק את הסינון מראש.

כעת, סובב את הצינורות כלפי מטה ב-14,000 גרם בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לאחר מכן, השליכו את הזרימה, המכילה את הננו-חלקיקים, והניחו את המסננים הפוכים בצינורות איסוף חדשים. סובב את המסננים הפוכים ב-1,000 גרם למשך שתי דקות כדי לאסוף ציטוקינים מרוכזים וממוזגים.

לאחר מכן, הגדל את נפח האוסף ל -400 מיקרוליטר עם DMEM טרי ואחסן את הצינורות על קרח. לצורך בדיקה זו, הקמת תאים היפותלמוסיים ממאגרים קפואים תוך שימוש באותן שיטות שתוארו להקמת תרביות מיקרוגליה. בסופו של דבר, השתמש בהם כדי לזרוע צלחות בעלות דופן שחורה ותחתית שקופה עם 5,000 תאים לבאר ב-200 מיקרוליטר של תוסף DMEM.

לאחר 24 שעות של תרבית, הסר 100 מיקרוליטר של מדיום והחלף אותו ב-100 מיקרוליטר של מדיום מסונן ומרוכז שנאסף מתרביות תאי המיקרוגליה המופעלות. לאחר מכן, דגרו את הצלחת למשך 24 שעות בתנאים סטנדרטיים. למחרת, הוסיפו 22 מיקרוליטר של מגיב רזזורין לכל באר, והמשיכו בדגירה למשך 20 דקות. לאחר מכן, בעזרת ספקטרופוטומטר רב-מצבי, קח מדד פלואורסצנטי כדי להעריך את כדאיות התא במונחים של יחידות פלואורסצנטיות יחסיות.