אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
מדעי המוח
0 צפיות • 2:46 דק׳ • July 8th, 2025
קח הקפאות של רקמות גולגולת פנים עובריות קבועות של עכבר המורכבות מתאי פסגה עצבית.
שטפו את החלקים במאגר המכיל חומר ניקוי לא יוני כדי להסיר את מדיום ההטבעה ולחלחל ממברנות, מה שמאפשר גישה למטרות תוך-תאיות.
הוסף פתרון חסימה כדי להרוות אתרי איגוד לא ספציפיים.
הסר את תמיסת החסימה העודפת. לאחר מכן, דגרו עם נוגדנים ראשוניים המכוונים לאנטיגנים גרעיניים, כגון גורמי שעתוק וסמני התפשטות.
יש לשטוף עם חוצץ כדי להסיר נוגדנים לא קשורים.
דגירה עם נוגדנים משניים מצומדים פלואורופור כדי להיקשר לנוגדנים הראשוניים הקשורים לאנטיגן.
הסר את הנוגדנים הלא קשורים באמצעות חוצץ.
הוסף מדיום נגד דהייה עם צבע גרעיני פלואורסצנטי וכסה בכיסוי.
הצבע מכתים את הגרעינים, והמדיום נגד דהייה מגן על אותות פלואורסצנטיים במהלך ההדמיה.
דמיין את החלקים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי להעריך ביטוי ולוקליזציה של סמנים גרעיניים, מה שמעיד על התפשטות תאי הפסגה העצבית ופעילות איתות.
שטפו את השקופיות ב-0.1% PBST שלוש פעמים למשך חמש דקות כל אחת, כדי לשטוף OCT ולחלחל את החלקים. הוסף 200 מיקרוליטר של תמיסת חסימה לכל שקופית ודגר בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן, הסר את תמיסת החסימה מבלי לשטוף את השקופית. הוסף 100 מיקרוליטר של נוגדן ראשוני מדולל בתמיסת חסימה לכל שקופית, ודגירה למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.
שוטפים את השקופיות עם PBS שלוש פעמים למשך 10 דקות כל אחת בטמפרטורת החדר. הוסיפו 100 מיקרוליטר של נוגדן משני מדולל בתמיסה חוסמת, ודגרו במשך שעה בטמפרטורת החדר, מוגנים מפני אור. יש לשטוף ב-PBS שלוש פעמים למשך 10 דקות כל אחת בטמפרטורת החדר, עדיין מוגנת מפני אור. כדי להרכיב את השקופיות, הוסף שתי טיפות של מדיום מונע דהייה עם DAPI בכל שקופית. מכסים בכיסוי ושומרים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שמוכנים לצילום.