הערכת השלמות המבנית של הצמתים העצביים-שריריים האורכיים הגביים בדרוזופילה

התחל עם בית החזה של דרוזופילה קבוע כימית וטרנסגני במאגר.

בבית החזה הטרנסגני, הצמתים העצביים-שריריים של שרירי האורך הגביים מכילים נוירונים המבטאים חלבון מוטנטי הגורם לניוון עצבי.

הסר את המאגר והקפיא את בית החזה כדי למנוע נזק לרקמות במהלך החצייה.

מוסיפים חיץ טרי ומעבירים את החזה לכלי חיתוך.

מקם את צד הגחון של בית החזה כלפי מעלה והסר את אשכולות תאי העצב כדי לחשוף את קו האמצע.

חצו לאורך קו האמצע כדי להשיג hemithoraces.

הסר רקמות עודפות.

דגרו את ההמיתוראסים במאגר חוסם כדי לחדור את הממברנות ולמנוע קשירת נוגדנים לא ספציפיים.

הוסף נוגדנים מצומדים פלואורופור המכוונים לגליקופרוטאין המתבטא בתאי עצב NMJ ובחוטי אקטין שרירים.

הסר נוגדנים לא קשורים.

מסדרים את ההמיטוראסים על מגלשת גשר, מוסיפים אמצעי הרכבה ומרכיבים את הרקמות.

דמיין תחת מיקרוסקופ.

בהשוואה לסוג הפראי, המוטאנטים מראים צביעה עצבית מופחתת, מה שמעיד על ניוון עצבי, בעוד שהשרירים מציגים פלואורסצנטיות שלמה.

לפני תחילת החצייה, לבשו כפפות מגן ומשקפי בטיחות ומלאו בקבוק דיואר בחנקן נוזלי. השתמש במפסק להב כדי לתפוס להב נוצה בזווית וכופף את הלהב כדי לשבור חתיכה קטנה. השתמש במפסק הלהב כדי לנעול את הלהב במקומו והשתמש בפיפטה מזכוכית פסטר כדי להסיר את כל ה-PBS מצינורות הדגימה.

השתמש בפינצטה קריוגנית כדי לטבול את הצינורות בבקבוק החנקן הנוזלי. לאחר 10 שניות, השתמש בפיפטה של פסטר כדי להוסיף כ-300 מיקרוליטר PBS קר כקרח לכל צינור על קרח ולהניח צד גחון אחד של בית החזה כלפי מעלה בצלחת חיתוך מצופה אלסטומר סיליקון בגודל 10 ס"מ המכילה PBS קר כקרח. השתמש בזוג מלקחיים עמומים כדי למקם את בית החזה ובזוג מלקחיים עדינים כדי להסיר חלק מגרעיני בית החזה כדי לחשוף את קו האמצע של בית החזה.

השתמש בקו האמצע של בית החזה כמדריך, השתמש בלהב כדי לבצע חתך רדוד דרך שליש מבית החזה, והשתמש במלקחיים הקהים כדי למקם את בית החזה בזווית של 45 מעלות. השתמש בלהב כדי לחתוך ישר את קו האמצע של בית החזה כדי להשיג שני המוטורקסים ולבצע בזהירות חתך אחד או שניים כדי להסיר את הרקמה העודפת מבלי לפגוע בשרירי האורך הגביים. לאחר מכן, הנח את דגימות רקמת השריר לתוך צינור מסומן כראוי של PBS.

כאשר כל דגימות בית החזה נחתכו, יש לחלחל את הרקמות במאגר חוסם למשך שעה אחת לפחות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. בתום הדגירה, מערבולת תמיסת כתמים מבנית טרייה שהוכנה והוסיפו 150 מיקרוליטר מהכתם לכל דגימה לדגירה של שעתיים על מסובב בטמפרטורת החדר בחושך. לאחר הצביעה, שטפו את הדגימות ב- PBST והניחו חמש תוויות חיזוק מוערמות וחתוכות לשניים, במרחק של 15 מיליליטר זו מזו, על שקופית מיקרוסקופ זכוכית אחת.

השתמש בקצה מיקרופיפטה שונה כדי להעביר את בית החזה לכל שקופית, והשתמש במגבון מעבדה כדי להסיר עודפי PBST. השתמש במלקחיים כדי לסדר את הדגימות כך שבית החזה יפנה כלפי מעלה. כאשר הדגימות מכוונות נכון, השתמש בקצה פיפטה של 200 מיקרוליטר כדי למרוח 70 מיקרוליטר של אמצעי הרכבה על כל שקופית, וכסה כל שקופית בכיסוי. לאחר מכן, השתמשו בלק כדי לצפות בנדיבות את הקצוות החיצוניים של הכיסויים כדי לקבל אטימה מלאה סביב כל רקמה.