יצירת אורגנואידים עצביים דופמינרגיים מתאי גזע עובריים אנושיים

קחו תאי גזע עובריים אנושיים, או hESCs, בבקבוק מצופה מטריצה חוץ-תאית.

החלף את המדיום במדיום אינדוקציה עצבי ודגירה, תוך הבחנה בין hESCs למושבות תאי אב עצביים, או NPC.

הוסף תמיסה אנזימטית כדי לנתק את המושבות.

צנטריפוגה, הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש תאים במדיום אינדוקציה עם גורמי גדילה כדי לתמוך בהתמיינות NPC.

הוסף את תרחיף התא על מיקרו-בארות בצורת פירמידה הפוכה ליצירת נוירוספרות תלת מימדיות.

העבר נוירוספרות לצלחת מצופה מטריצה חוץ-תאית המכילה מדיום התמיינות עם גורמי גדילה ומולקולות קטנות. דגירה תחת תסיסה כדי לקדם התמיינות לנוירוני אב דופמינרגיים.

החלף את המדיום במדיום התבגרות עצבית והנח נוירוספרות על דיסק ממברנה בהכנסת באר תרבית, מה שמאפשר דיפוזיה של אוויר וחומרים מזינים.

דגירה בתנאים סטטיים ליצירת אורגנואידים תלת מימדיים המורכבים מנוירונים דופמינרגיים בוגרים.

אורגנואידים אלה, המחקים מוח מתפתח, שימושיים לחקר ניוון נוירונים דופמינרגיים, מאפיין של מחלת פרקינסון.

החלף את מדיום תאי הגזע המשמש לשמירה על תכונות פלוריפוטנטיות של hESCs, במדיום נטול סרום המכיל קוקטייל עיכוב SMAD כפול להתחלת אינדוקציה עצבית, ו-10 מעכבי ROCK מיקרו-מולאריים כדי להגדיל את שיעור ההישרדות של תאים במהלך המעבר למחרת. ביום הראשון, הכינו את צלחת המיקרו-באר עם 2.5 מיליליטר לבאר של מדיום נטול סרום המכיל את אותו ריכוז של מעכב ROCK ומולקולות עיכוב SMAD כפולות.

כדי להבדיל תאים לכיוון דפוס הגחון של הצינור העצבי, הוסף SHH ו-FGF8 ב-100 ננוגרם למיליליטר ושני אגוניסטים מוחלקים מיקרו-מולריים. לאחר הוספת המדיום, צנטריפוגה את הצלחת ב -1,200 פעמים גרם למשך חמש דקות כדי להסיר בועות אוויר מהמיקרובארות. לאחר שצלחת המיקרובאר מוכנה לשימוש עם חצי מדיום מבדיל, הסר את המדיום של hESCs ושטוף במהירות עם PBS ללא סידן ומגנזיום כלוריד.

לפרק את המושבות לתרחיף חד-תאי על ידי הוספת 7.5 מ"ל של תמיסה אנזימטית רקומביננטית לבקבוק T75. דגרו על התאים במשך שתי דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן הוסיפו 7.5 של DMEM F-12. לאחר מכן, אספו את תרחיף התאים, וצנטריפוגה ב -300 פעמים גרם למשך חמש דקות. לאחר מכן, הסר את הסופרנטנט וספור את התאים באותו מדיום המשמש להכנת צלחת המיקרווול.

התאם את נפח המדיום כדי לקבל תרחיף תאים, המאפשר ליצור נוירוספרות המכילות 1,000 תאים למיקרווול, על ידי הכנת 4.7 מיליון תאים ב-2.5 מיליליטר מדיום, והוספתו ל-2.5 מיליליטר המדיום הקודמים שכבר הונחו בצלחת. על מנת להפיץ נכון את התאים בכל מיקרובאר, יש לנער בעדינות את הצלחת ולצנטריפוגה אותה ב -300 פעמים גרם למשך חמש דקות. לאחר מכן, דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות כדי ליצור כדורים.

ביום השני, שטפו בעדינות את המיקרו-בארות במדיום, והעבירו את הכדורים בצלחת שש בארות שטופלו ברקמות. מניחים את הכדורים בסיבוב על 37 מעלות צלזיוס, ומחליפים מחצית מהמדיום במדיום טרי כל יומיים-שלושה. ביום 3 עד 13, כדי לשפר את האינדוקציה העצבית ולהמיר לאבות עצביים עם זהות מוח אמצעי, השלם את המדיום עם שלושה מעכבי GSK-3-beta מיקרומולריים. פצל את הדגימה לשתי שש צלחות באר חדשות שטופלו ברקמות כדי להפחית את צפיפות הכדור ולמנוע צבירת כדורים.

ביום השמיני, התחילו את ההתבגרות העצבית על ידי מעבר למדיום חדש עם גורמי גדילה, והחליפו את המדיום כל יומיים-שלושה. ביום ה-21, הנח תוספת צלחת תרבית אחת בבאר אחת של צלחת חדשה בת שש בארות, והוסף 1.2 מיליליטר של מדיום התבגרות עצבית המשמש להתמיינות נוירוספרה מתחת לתוספת הממברנה. לאחר מכן, הניחו את קרום ה-PTFE על תוספת צלחת תרבית.

לבסוף, כדי ליצור את האורגנואיד העצבי, זרע כ-100 נוירוספרות בתנאי ממשק אוויר-נוזל על קרום ה-PTFE. הפסק את הסיבוב משלב זה והחלף את המדיום כל יומיים-שלושה עד להשגת נקודת הזמן הנדרשת של התמיינות.