צביעה אימונופלואורסצנטית של סיאלוגליקופפרוטאינים בתאי אב עצביים ובתאי עצב

קחו לדוגמה תאי גזע עצביים ראשוניים ותאי אב ונוירונים, שיש להם סיאלוגליקופרוטאינים המתויגים על ידי מדווח חומצה סיאלית.

הוסף פרפורמלדהיד כדי לתקן את התאים. הסר עודפי פרפורמלדהיד באמצעות חיץ.

דגירה עם תערובת תגובה המכילה בדיקות כימיות מבוססות ביוטין, חומר הפחתה וזרז מבוסס מתכת.

חומר ההפחתה מפעיל את הזרז, ומקל על ביוטינילציה של סיאלוגליקופרוטאינים.

הסר את תערובת התגובה ושטוף עם חיץ. הוסף סטרפטווידין מצומד פלואורופור כדי לקשור את הסיאלוגליקופרוטאינים הביוטיניים.

הסר את הסטרפטווידין הלא קשור ושטוף עם חיץ. הוסף חלבונים וחומר ניקוי לא יוני כדי לחסום אתרים לא ספציפיים ולחלחל לתאים.

הסר את התמיסה הזו ודגר עם נוגדנים ראשוניים המכוונים לחלבונים תאיים ספציפיים.

הסר את הנוגדנים הלא קשורים.

דגירה עם נוגדנים משניים מתויגים פלואורופור וצבע פלואורסצנטי כדי לקשור נוגדנים ראשוניים הקשורים לחלבון ולתייג את הגרעינים.

הסר מולקולות לא קשורות. לשטוף עם חיץ.

באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, דמו את התאים כדי לדמיין את הסיאלוגליקופרוטאינים הפלואורסצנטיים והחלבונים התאיים.

ראשית, הסר את התוספות מלוחות הקוקולטורה, ושאף את מדיום התרבות מתחתית הבארות. לאחר מכן, שטפו את התאים העצביים פעם אחת עם PBS שחומם מראש. שאפו את ה-PBS מהבארות, והוסיפו 1 מיליליטר של פרפורמלדהיד מקורר מראש של 4% ב-PBS לכל באר.

תקן את התאים בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר מכן, שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS מקורר מראש. שאפו את ה- PBS, והוסיפו 1 מיליליטר של מאגר מצומד ביוטין טרי I לכל באר. דוגרים בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר מכן, שאפו את מאגר התגובה מהבארות, ושטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS. הוסף 1 מיליליטר של מאגר מכתים לכל באר תאים, ודגר בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.

לאחר מכן, שאפו את מאגר הצביעה מהבארות, ושטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS מקורר מראש. הוסף 1 מיליליטר של חיץ חוסם לכל באר תאים, ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. הסר את המאגר החוסם מהבארות, והוסף 1 מיליליטר של תמיסת נוגדנים ראשונית לכל באר. דגרו על התאים למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.

למחרת, הסר את תמיסת הנוגדנים העיקרית מהבארות. שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS מקורר מראש. שאפו את ה-PBS מהבארות, והוסיפו 1 מיליליטר של נוגדן משני לכל באר. דגרו את התאים בטמפרטורת החדר למשך שעתיים. לאחר מכן, שאפו את התמיסה מהבארות, ושטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS מקורר מראש.