הערכה חוץ גופית של β עמילואיד מצטבר על קריסת חרוט גדילה עצבי

התחל עם שקופית תרבית מרובת בארות המכילה נוירונים מעובר עכבר במדיום.

הנוירונים מציגים חרוטי גדילה בקצות האקסונים הגדלים שלהם. מבנים אלה כוללים הקרנות דקות הנקראות פילופודיה ושלוחות דמויות יריעות הנקראות למלופודיה, המורכבות מחוטי אקטין ומיקרו-צינורות, מרכיבים של השלד הציטולוגי.

טפל בבארות הבדיקה בחלבון עמילואיד-β מצטבר, או Aβ, ובבארות הבקרה בתמיסת רכב.

בבארות הבדיקה, Aβ מצטבר נקשר לקולטני הממברנה, ויוזם איתות במורד הזרם המזרחן חלבונים המווסתים את השלד הציטולוגי.

החלבונים הזרחניים משבשים את חוטי האקטין והמיקרו-צינורות, מערערים את השלמות המבנית של חרוט הגידול וגורמים לקריסתו.

דגירה עם מקבע לשימור המבנה התאי, ואז שטפו את התאים והרכיבו אותם להדמיה.

בעזרת מיקרוסקופ השווה את המבנים התאיים בבארות הבדיקה והבקרה.

התרחשות מוגברת של קריסת חרוט גדילה בתאי עצב שטופלו ב- Aβ מעידה על ההשפעה הרעילה של אגרגטים Aβ.

התחל בדיקה זו לפחות שבוע מראש על ידי פתיחת בקבוקון טרי של A-beta-42 באורך מלא שהושג מסחרית והמסת התוכן במים מזוקקים סטריליים לריכוז של 0.5 מילימולר. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שבעה ימים כדי לגרום לצבירה ורעילות. יש להכין כמויות של A-beta-42 מצטבר, ולאחסן בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.

ביום הרביעי של התרבית העצבית, יש לטפל בבארות עם 100 מיקרוליטר של 0.5 מיקרו-מולרי מצטבר A-beta-42 או תמיסת רכב במדיום B למשך שעה אחת כפי שהודגם קודם לכן. לאחר שחלפה השעה, הסר את מדיום התרבית, וקבע מיד את הנוירונים עם 4% פרפורמלדהיד המכיל 4% סוכרוז ב-PBS למשך שעה ב-37 מעלות צלזיוס על פלטה חמה.

קיבוע חשוב בעיקר מכיוון ששמירה על צורת חרוטי הגדילה היא קריטית לפרוטוקול זה.

לאחר הקיבוע יש לשטוף את הנוירונים שלוש פעמים עם PBS. לאחר מכן, לאחר הסרת החדר, הרכיבו את הנוירונים עם מדיום הרכבה מימי. יבש את אמצעי ההרכבה ב -4 מעלות צלזיוס למשך יומיים עד ארבעה ימים. צלם את כל השטח של כל באר עם עדשת אובייקט יבשה פי 20 במיקרוסקופ הפוך.

לכידת וניתוח האזור כולו בכל באר חשובה למניעת סובייקטיביות.

סווג את הנויריטים הארוכים ביותר של כל נוירון בשלב 3 או 4 כאקסונים. חרוטי גדילה אקסונליים חסרי lamellipodia או בעלי פחות משלושה filopodia נחשבים לחרוטי גדילה שהתמוטטו.