הדמיה של פפטידים עמילואיד-בטא בפרוסות מוח קליפת המוח האנושית

קחו שקופית זכוכית המכילה פרוסה קליפת המוח של רקמת מוח שנאספה מחולה אלצהיימר. הרקמה מכילה משקעי עמילואיד-בטא בלתי מסיסים בתוך הפרנכימה ונימי המוח.

טבלו את השקופית באלכוהול מדולל כדי להסיר שומנים ומלחים.

שטפו עם אלכוהול מוחלט כדי לייבש את הרקמה, ולאחר מכן מרחו מקבע כדי לשמר את ארכיטקטורת הרקמות.

יבש את המגלשה בוואקום, והסר כל לחות.

טפל באדי חומצה פורמית בסביבה לחה כדי לפרק אגרגטים של עמילואיד-בטא לפפטידים מסיסים קטנים יותר.

באמצעות סורק אופטי, צור תמונות של התכונות המבניות של הרקמה כדי לפרש נתונים מספקטרומטריית המסה של ההדמיה.

מרססים תמיסת מטריצה על הדגימה.

בעזרת ספקטרומטר מסה, יש למרוח לייזר שהמטריצה סופגת כדי ליינן את הפפטידים. לאחר מכן גלאי מזהה אותם על סמך יחס המסה למטען שלהם.

לנתח את הנתונים כדי לייצר תמונות, לחשוף את התפלגות פפטידי העמילואיד-בטא בפרנכימה של הרקמה ובנימי המוח.

כדי לשטוף את חלקי הרקמות, טבלו את הדגימות ב-40 עד 100 מיליליטר של 70% אתנול בצנצנת מכתים מזכוכית למשך 30 שניות כדי להסיר שומנים אנדוגניים ומלחים אנאורגניים. שטפו את הדגימות באמצעות רצף הכביסה המפורט בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, יבש את הדגימות בוואקום למשך 30 דקות.

כעת, טפל בקטעי הרקמה באדי חומצה פורמית ליינון טוב יותר של חלבוני העמילואיד-בטא מרקמת המוח שלאחר המוות. לשם כך מכינים את התנור בחום של 60 מעלות צלזיוס וצלחת זכוכית דגירה עם 5 מיליליטר של 100% חומצה פורמית. שמור על לחות האוויר בצלחת זכוכית הדגירה ברמת הרוויה.

מניחים את מגלשות הרקמה בכלי זכוכית הדגירה תוך הימנעות מטבילה בחומצה הפורמית ומטפלים במשך שש דקות. צלם תמונה אופטית של הדגימות באמצעות סורק סרטים, סורק ג'ל או מיקרוסקופ דיגיטלי. בצע שלב זה בטמפרטורת החדר.

יישור התמונה האופטית של הדגימות הכרחי כאשר יעד הדגימה ממוקם בתוך המכשיר. בדרך כלל, לא ניתן יהיה לזהות את קטע הרקמה מתחת לשכבת המטריצה. כדי לתאם את התמונות האופטיות עם הדגימות, צור סימני הנחיה הנראים הן בתמונה האופטית והן מתחת לשכבת המטריצה באופטיקה של המצלמה. הדרך הקלה ביותר היא לזהות לפחות שלושה סימני נוזל תיקון סביב הדגימה לפני צילום התמונה האופטית.

כדי לרסס את המטריצה במרסס קולי, הסר את הרקמה שיש לרסס מהמייבש והנח אותה בתא. ודא שהרקמה אינה מכסה את חלון החיישן. התחל את ההכנה על ידי לחיצה על כפתור התחל. בדרך כלל, זמן ההכנה הוא בסביבות 90 דקות.

התכשיר יוסדר באופן אוטומטי באמצעות ניטור עובי ורטיבות שכבת המטריצה. לחלופין, כדי לרסס את תמיסת המטריצה על משטח הרקמה עם מרסס אוטומטי, השתמש במערכת משאבת ממס המוגדרת על 10 PSI ו-0.15 מיליליטר לדקה כדי לספק את תמיסת המטריצה.

זרימה קבועה של גז נדן מחומם תועבר במקביל לתרסיס תמיסת המטריצה. בצע ניסויי הדמיה בתפוקה גבוהה וברזולוציה מרחבית גבוהה עם MALDI-IMS. למדידות ספקטרומטריית מסה, הגדר את אזורי הרקמה באמצעות תוכנת הבקרה MALDI ותוכנת ניתוח הנתונים.

רכוש ספקטרום במצב ליניארי חיובי עם טווח יחס מסה למטען של 2,000 עד 20,000 ורזולוציה מרחבית של 20 ו-100 מיקרון. כדי להפוך את תקן הכיול, ממיסים את תקן כיול הפפטיד בתקן כיול החלבון ביחס של 1 ל-4 עם CHCA בתמיסת TA30, ולאחר מכן מדללים אותו פי 10.

הנח 1 מיקרוליטר של תקן כיול על השקופית בארבעה מקומות שונים. באמצעות תוכנת היסטולוגיה מולקולרית, שכב על תמונות אותות מרובות כדי למצוא את המתאם המרחבי של אותות שונים, כגון פפטידים שונים של עמילואיד-בטא המתמקמים בפלאק סנילי בדפנות העורקים.