איתור מיקרו-דימומים מוחיים במודל חולדה

מיקרו-דימומים מוחיים, או CMHs, הם דימומים מוחיים נוירו-דלקתיים הנגרמים על ידי הפרעה במחסום הדם-מוח, וכתוצאה מכך דליפה של כדוריות דם אדומות, או RBCs, לרקמת המוח.

כדי לזהות CMHs, התחל עם רקמת מוח קבועה מחולדה עם CMHs.

טבלו את הרקמה בסוכרוז להגנה מפני הקפאה.

בעזרת מיקרוטום קריו, חתכו את הרקמה ואספו קטע על מגלשת זכוכית.

שטפו כדי להסיר שאריות קיבוע.

מרחו צבע המטוקסילין הקשור לקטיון מתכת המקיים אינטראקציה עם DNA טעון שלילי, ומכתים את הגרעין בצבע אדמדם-סגול.

לאחר מכן יש למרוח חומצה-אלכוהול כדי להסיר עודפי צבע, ולאחר מכן למרוח חומר מכחלחל אלקליין כדי לנטרל את הסביבה החומצית ולהמיר את הצבע לצורתו הכחולה, תוך שיפור הניגודיות.

שטפו את הרקמה באלכוהול כדי לשפר את חדירת הכתם, ולאחר מכן מרחו אאוזין כדי להכתים את ה-RBCs באדום-כתום ורכיבי הרקמה בוורוד.

ייבשו את הרקמה באמצעות ריכוזי אלכוהול הולכים וגדלים ונקו אותה עם קסילן להדמיה מיקרוסקופית.

צלם תמונות כדי לזהות את ה-RBCs שדלפו בצבע אדום-כתום, ואישור CMHs.

לאחר בידוד המוח, טבלו אותו ב-20% סוכרוז ב-PBS למשך שש שעות לפחות או עד שהמוח שוקע לתחתית הצינור. שנה את התמיסה ל -30% סוכרוז, ותקן אותה למשך שש שעות נוספות.

לבסוף, הכינו חלקי רקמת מוח בעובי 10 מילימטר באמצעות קריוסטט. התחל לצבוע H&E על ידי שטיפת השקופיות במים מזוקקים. לאחר מכן, טבלו בתמיסת המטוקסילין למשך שמונה דקות. לאחר הצביעה יש לשטוף במי ברז זורמים למשך חמש דקות. יש להבדיל ב-1% חומצה-אלכוהול למשך 30 שניות.

לאחר שטיפה במי ברז זורמים למשך דקה אחת, יש להכתים במי אמוניה 0.2% או בתמיסת ליתיום קרבונט רוויה למשך 30 שניות עד דקה. לאחר מכן, שטפו במי ברז זורמים למשך חמש דקות. כתם נגד עם תמיסת אאוזין למשך 30 שניות עד דקה. התייבשו באמצעות 90% אלכוהול, לאחר מכן 95% אלכוהול, ואלכוהול מוחלט למשך 0.5 עד 2 דקות כל אחד.

לאחר התייבשות, יש לנקות בקסילן למשך 30 שניות. לאחר ההרכבה, נתח את צביעת H&E באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בעל שדה בהיר. תאי הדם האדומים המשתחררים מכלי הדם, שהם מרכיבים של CMHs, מופיעים באדום-כתום תחת צביעת H&E.