הכנת תאי עצב בתרבית לאנליזה אופטית של בועיות סינפטיות ממוחזרות

התחל עם כיסוי המכיל נוירונים מתורבתים המבטאים חלבוני קרום שלפוחית סינפטית, כולל סינפטופיזין מתויג פלואורסצנטי וסינפטוטגמין -1.

הסר את המדיום, הוסף תערובת של מאגר דפולריזציה ונוגדנים ראשוניים, ואז דגירה.

יוני החיץ נכנסים לתאים, וממריצים את היתוך השלפוחיות הסינפטיות עם הממברנה, החושפת את synaptotagmin-1.

הנוגדנים העיקריים נקשרים באופן סלקטיבי לסינפטוטאגמין-1 שנחשף.

השליכו את המאגר ושטפו עם המדיום כדי להסיר נוגדנים לא קשורים.

הכניסו מדיום טרי ודגרו כדי להקל על הפנמת הממברנה, וצרו שלפוחיות ממוחזרות עם סינפטופיזין מסומן וסינפטוטאגמין -1 הקשור לנוגדנים.

הסר את המדיום, תקן את התאים ושטוף.

הציגו מאגר חוסם מבוסס דטרגנטים עם נוגדנים משניים המצומדים לפלואורופור.

חומר הניקוי מחלחל לתאים, ומאפשר לנוגדנים המשניים לקיים אינטראקציה עם סינפטוטאגמין-1 הקשור לנוגדנים.

הרם את הכיסוי, שטוף אותו במים וייבש אותו.

הנח את כיסוי הכיסוי עם הפנים כלפי מטה על שקופית עם מדיום הטבעה לניתוח אופטי של השלפוחיות הממוחזרות עם התווית הכפולה.

יש לחמם מראש 600 מיקרוליטר של מאגר דפולריזציה 1x ו-10 מיליליטר של תרבית תאים בינונית עד 37 מעלות צלזיוס באמבט המים. הוסף 1 מיקרוליטר של נוגדן נגד SYT1 של עכבר למאגר הדפולריזציה והמערבולת 1x למשך 10 שניות. לאחר הסרה והשלכה של מדיום תרבית התאים מהתאים, הוסף 200 מיקרוליטר מתערובת נוגדני הדפולריזציה לכל באר.

דגרו את הצלחת למשך 5 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ בחממה. הסר והשליך את תערובת נוגדני הדפולריזציה ושטוף את התאים שלוש פעמים במדיום תרבית תאים. מוסיפים 1 מיליליטר של מדיום תרבית תאים לכל באר ודוגרים למשך 30 שניות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, הסר 750 מיקרוליטר של מדיום והוסף את אותה כמות של מדיום טרי. חזור על תהליך זה שלוש פעמים. לאחר מכן, הסר והשליך את מדיום תרבית התאים והוסף 300 מיקרוליטר של 4% PFA ב-1x PBS.

לבסוף, יש לדגור במשך 20 דקות בחום של 4 מעלות צלזיוס לפני הכביסה שלוש פעמים למשך 5 דקות כל אחת עם PBS אחד. לדלל את הנוגדן המשני המצמד לפלואורופור ב-200 מיקרוליטר של מאגר חוסם לכל באר בדילול של 1 עד 1,000. הסר והשליך את ה-PBS 1x מכל באר המכילה תלושי כיסוי עם הנוירונים המתורבתים.

הוסיפו 200 מיקרוליטר של תערובת נוגדנים חוסמים לכל באר, ודגרו במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה יש לשטוף את התאים שלוש פעמים למשך 5 דקות עם 1 מיליליטר של 1x PBS.

לאחר מכן, הוסף טיפה של 7 מיקרוליטר של מדיום הטבעה על שקופית המיקרוסקופ. הסר את הכיסוי מצלחת 24 הבארות על ידי הרמתו בעזרת צינורית ותפיסתו במלקחיים. טבלו את הכיסוי במים מזוקקים כדי להסיר את ה-PBS, וייבשו אותו בזהירות על ידי נגיעה בקצה אחד ברקמה רכה.

הפוך את החלקת הכיסוי על טיפת המדיום המוטמעת כך שהמשטח הנושא את התאים פונה לשקופית המיקרוסקופ, ובכך להטמיע את התאים במדיום ההטבעה. השאירו את המגלשות לייבוש מתחת למכסה המנוע למשך שעה עד שעתיים, וכסו אותן כדי למנוע חשיפה לאור. אחסן את השקופיות המיובשות בקופסת שקופיות מיקרוסקופ בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.