הכנת תאי עצב בתרבית לאנליזה אופטית של בועיות סינפטיות ממוחזרות

התחל עם כיסוי המכיל נוירונים מתורבתים המבטאים חלבוני קרום שלפוחית סינפטית, כולל סינפטופיזין מתויג פלואורסצנטי וסינפטוטגמין -1.

הסר את המדיום, הוסף תערובת של מאגר דפולריזציה ונוגדנים ראשוניים, ואז דגירה.

יוני החיץ נכנסים לתאים, וממריצים את היתוך השלפוחיות הסינפטיות עם הממברנה, החושפת את synaptotagmin-1.

הנוגדנים העיקריים נקשרים באופן סלקטיבי לסינפטוטאגמין-1 שנחשף.

השליכו את המאגר ושטפו עם המדיום כדי להסיר נוגדנים לא קשורים.

הכניסו מדיום טרי ודגרו כדי להקל על הפנמת הממברנה, וצרו שלפוחיות ממוחזרות עם סינפטופיזין מסומן וסינפטוטאגמין -1 הקשור לנוגדנים.

הסר את המדיום, תקן את התאים ושטוף.

הציגו מאגר חוסם מבוסס דטרגנטים עם נוגדנים משניים המצומדים לפלואורופור.

חומר הניקוי מחלחל לתאים, ומאפשר לנוגדנים המשניים לקיים אינטראקציה עם סינפטוטאגמין-1 הקשור לנוגדנים.

הרם את הכיסוי, שטוף אותו במים וייבש אותו.

הנח את כיסוי הכיסוי עם הפנים כלפי מטה על שקופית עם מדיום הטבעה לניתוח אופטי של השלפוחיות הממוחזרות עם התווית הכפולה.

יש לחמם מראש 600 מיקרוליטר של מאגר דפולריזציה 1x ו-10 מיליליטר של תרבית תאים בינונית עד 37 מעלות צלזיוס באמבט המים. הוסף 1 מיקרוליטר של נוגדן נגד SYT1 של עכבר למאגר הדפולריזציה והמערבולת 1x למשך 10 שניות. לאחר הסרה והשלכה של מדיום תרבית התאים מהתאים, הוסף 200 מיקרוליטר מתערובת נוג