אימונוסטיין של נוירונים שטופלו בצברי אלפא-סינוקלאין

התחל בתרבית נוירונים דבוקה המטופלת באגרגטים אלפא-סינוקלאין או אלפא-S, שהם גושים של חלבון מקופל בצורה לא נכונה.

גושים אלה מצטברים ליצירת תכלילים תוך-תאיים.

החלף את המדיה בתמיסת קיבוע כדי לשמור על שלמות התא.

הסר את תמיסת הקיבוע ושטוף עם חיץ.

לאחר מכן, הוסף חומר פעילי שטח כדי לחלחל את קרום התא.

הסר את חומר פעילי השטח ושטוף עם חיץ.

הציגו תמיסת חסימה למניעת קשירת נוגדנים לא ספציפיים.

כעת, דגרו עם נוגדנים ראשוניים הנקשרים במיוחד לתכלילים של אלפא-S וחלבונים מבניים.

יש לשטוף עם חוצץ כדי להסיר נוגדנים לא קשורים.

דגירה עם נוגדנים משניים המסומנים בפלואורסצנט.

הסר נוגדנים לא קשורים.

הוסף כתם פלואורסצנטי כדי לסמן את הגרעין.

הסר את הכתם ושטוף עם חיץ.

בעזרת אמצעי הרכבה, הרכיב את הכיסוי עם נוירונים על שקופית.

תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, התבונן בתכלילי אלפא-S בעלי תווית חיסונית בתוך הנוירון.

כדי לבצע אימונופלואורסצנציה במכסה אדים כימי יש לתקן את הנוירונים עם 2% פרפורמלדהיד ב-PBS ותמיסת סוכרוז 5% למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר מבלי לרעוד. לאחר 15 דקות, הסר את תמיסת הקיבוע ושטוף לזמן קצר את הנוירונים עם PBS שלוש פעמים.

לאחר מכן, לחדור את הנוירונים עם 0.3% של פעילי שטח לא יוניים ב-PBS למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו לזמן קצר את תאי העצב עם PBS שלוש פעמים. דגרו על הנוירונים עם 3% FBS ב-PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר אורביטלי כדי לחסום אתרי קישור לא ספציפיים. לאחר מכן, דגרו את הנוירונים עם נוגדן ראשוני מתאים המומס ב-3% FBS ב-PBS למשך הלילה בחדר הקירור או במקרר למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס על שייקר מסלולי.

למחרת, הסר את תמיסת הנוגדנים ושטוף את התאים לזמן קצר עם PBS במשך שלוש פעמים. לאחר מכן, דגרו את הנוירונים עם הנוגדן המשני הפלואורסצנטי המתאים המומס ב-3% FBS ב-PBS למשך שעה בטמפרטורת החדר בחושך על שייקר מסלולי.

הסר את תמיסת הנוגדנים ושטוף קצרות עם PBS שלוש פעמים. לאחר מכן, צבעו את הנוירונים בתמיסת DAPI למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך על שייקר מסלולי. לאחר 15 דקות, הסר את תמיסת הנוגדנים ושטוף קצרות עם PBS שלוש פעמים. התקן את החלקות הכיסוי על המגלשה באמצעות אמצעי הרכבה נגד דהייה.