צביעה אימונופלואורסצנטית של אוכלוסיות נוירונים במערכת העיכול העוברית

קח מערכת עיכול עוברית קבועה וטרנסגנית של עכבר בשלב ההתפתחותי הרצוי.

מערכת העצבים המעי של מערכת העיכול כוללת נוירונים מעיים ונוירונים כולינרגיים המבטאים כולין אצטילטרנספראז.

נוירונים כולינרגיים אלה מבטאים גם חלבון פלואורסצנטי המונע על ידי מקדם כולין אצטילטרנספראז.

דגרו את המסלול עם חומר ניקוי לא יוני וחלבונים כדי לחלחל לתאים ולמנוע קשירת נוגדנים לא ספציפיים.

החלף בנוגדנים ראשוניים. דגירה כדי שהנוגדנים יקשרו את חלבוני המטרה שלהם בנוירונים, בהתאמה.

הסר את הנוגדנים הלא קשורים ושטוף עם חיץ.

דגירה עם נוגדנים משניים מצומדים פלואורופור כדי לקשור באופן ספציפי את הנוגדנים הראשוניים הקשורים לחלבוני המטרה.

הסר את עודפי הנוגדנים ושטוף עם חיץ.

טבלו את המסלול המסומן במצע הרכבה המכיל צבע גרעיני כדי להכתים את הגרעינים. כעת, הרכיב כיסוי.

באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית, דמיין ונתח את התפלגות הנוירונים הכולינרגיים במערכת העיכול.

הנח את דרכי העיכול בשפופרת של 0.2 מיליליטר המכילה תמיסת חסימה, המורכבת מ-1x PBS, 3% אלבומין בסרום בקר, 0.1 Triton X-100 ורוק למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר החסימה, יש לשאוב את תמיסת החסימה עם פיפטת פסטר עדינה ולהחליף בדילול אופטימלי של נוגדנים ראשוניים מדוללים בתמיסת חסימה.

דגירה במשך ארבע שעות בטמפרטורת החדר או לילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס על משטח הנדנדה. לאחר הדגירה הר