בידוד צברי חלבונים בלתי מסיסים בדטרגנט מרקמת מוח אנושית לאחר המוות

התחל עם דגימת רקמת מוח אנושית קפואה לאחר המוות ממקרה מאומת של מחלה ניוונית.

כורת חומר אפור עשיר באגרגטים של חלבונים בלתי מסיסים, סימן היכר של המחלה.

העבירו את הרקמה להומוגנייזר.

הוסף מאגר המכיל מעכבים והומוגניזציה כדי לשחרר רכיבים תוך תאיים.

המעכבים חוסמים אנזימי פרוטאז ופוספטאז, ומונעים פירוק חלבונים.

העבירו את ההומוגנאט לצינור והוסיפו מאגר ניקוי יוני. דגירה.

חומר הניקוי מסיס חלבונים מקופלים באופן טבעי, בעוד שאגרגטים חלבונים מקופלים בצורה לא נכונה נשארים שלמים.

סוניקט להשלמת דיסוציאציה תאית.

העבירו את ההומוגנאט לצינור אולטרה-צנטריפוגה וצנטריפוגה במהירות גבוהה.

האגרגטים מתיישבים בתחתית.

הסר את הסופרנטנט המכיל חלבונים מסיסים בחומרי ניקוי.

שטפו את האגרגטים עם מאגר ניקוי יוני, צנטריפוגה והסירו את הסופרנטנט.

הוסף חוצץ אוריאה כדי לנטרל את מצברי החלבון, מה שהופך אותם למסיסים.

העבירו את אגרגטי החלבון המסיסים לצינור וסוניקט קצר כדי להבטיח פירוק מוחלט.

השג רקמת מוח קפואה לאחר המוות מבקרה בריאה ומאושרת פתולוגית לאלצהיימר. השתמש במלקחיים ובסכין גילוח כדי להוציא כ-250 מיליגרם חלקים של חומר אפור מכל דגימת רקמה. אפשרו למקטע המוח להפשיר למשך דקה אחת. כעת, חתכו חתיכת רקמה לקוביות של כשני מילימטרים כשהיא מפשירה. מעבירים לצינור הומוגנייזר מקורר מראש של שני מיליליטר על קרח.

זכור להימנע מחומר לבן ומכלי דם גדולים.

עבדו במהירות והניחו את הרקמה על סירות שקילה חד פעמיות. הקפד למנוע את הפשרת הרקמה על ידי הנחת סירת השקילה עם רקמת המוח לעתים קרובות במיכלי קלקר עם קרח יבש. לאחר ניתוח ושקילה של כל פיסות הרקמה הנדרשות, הסר סירת משקל המכילה פיסת רקמה מקרח יבש.

לאחר מכן, הוסיפו חמישה מיליליטר של בופר קר ודל מלח עם קוקטייל מעכב פרוטאז ופוספטאז לכל גרם רקמה, והומוגניזציה על קרח באמצעות כ-10 משיכות של עלי A בעל מרווח גבוה ו-15 משיכות של עלי B בעל מרווח נמוך. לאחר מכן, השתמש בפיפטה פסטר מזכוכית בגודל תשעה אינץ 'כדי להעביר כל הומוגנאט לצינור פוליפרופילן של שני מיליליטר. הציגו את ההומוגנאט הנותר לצינורות נוספים של 1.5 מיליליטר מסומנים באופן דומה לאחסון בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.

כדי להמשיך בפיצול, הוסף 100 מיקרוליטר של נתרן כלורי מולארי ו-100 מיקרוליטר של 10% סרקוסיל לכל אליקוט של 0.8 מילימטר. מערבבים היטב על ידי היפוך, ולאחר מכן דוגרים על קרח למשך 15 דקות. לאחר הדגירה, השתמש בסוניקטור המצויד בבדיקה מיקרו-קצה כדי לספק שלושה פולסים של 5 שניות במשרעת של 30%.

לאחר השימוש בשיטת החומצה הביצינכונית לקביעת ריכוזי החלבון של ההומוגנטים, הוסף לכל דגימה מאגר סרק קר כקרח עם מעכבי פרוטאז ופוספטאז לריכוז סופי של 10 מיליגרם למילימטר. לאחר מכן, העבירו 500 מיקרוליטר מכל דגימה לצינורות אולטרה-צנטריפוגה פוליקרבונט בנפח 500 מיקרוליטר.

טען צינורות לרוטור מקורר מראש, ואולטרה-צנטריפוגה ב-180,000 פעמים גרם למשך 30 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. לאחר הצנטריפוגה, העבירו את הסופרנטנטים המסיסים S1 sarkosyl לצינורות של 1.5 מיליליטר ואחסנו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר סרק לצינורות האולטרה-צנטריפוגה המכילים את שברי P1 הבלתי מסיסים של חומר הניקוי והשתמש בקצה הפיפטה כדי לעקור את הכדורים מתחתית צינורות האולטרה-צנטריפוגה.

לאחר מכן, העבירו את כדורי ה-P1 התלויים לצינורות אולטרה-צנטריפוגות חדשים בנפח 500 מיקרוליטר, איזון זוגות וצנטריפוגה ב-180,000 פעמים גרם למשך 30 דקות נוספות ב-4 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט S2, ואז הוסיפו 50 עד 75 מיקרוליטר של חוצץ אוריאה עם קוקטייל מעכבי פרוטאז ופוספטאז לכדורים הבלתי מסיסים של סרקוזיל ודגרו במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי להמיס את כדור ה-P2.

לאחר הדגירה, העבירו את כדורי ה-P2 התלויים לצינורות מסומנים של 0.5 מילימטר והמיסו את הכדורים במלואם באמצעות סוניקציה קצרה של שנייה אחת במשרעת של 20%. קבע את ריכוזי החלבון של השברים המסיסים בסרקוזיל ובסרקוזיל הבלתי מסיסים בשיטת בדיקת BCA.