זיהוי של לוקליזציה משותפת של אורקסין וקולטן קנבינואידים בדגי זברה שמנים הנגרמים על ידי דיאטה

במוח דג הזברה, נוירונים מבטאים קולטני אורקסין וקנבינואידים המווסתים את חילוף החומרים.

בדג זברה המושרה על ידי תזונה, או DIO, קולטנים אלה מתמקמים יותר ויותר ליצירת הטרומרים, משנים את האיתות במורד הזרם ומשפיעים על ויסות חילוף החומרים.

קח חתכים קריולוגיים של רקמת המוח הן מביקורת והן מדגי זברה DIO. שטפו את החלקים עם מאגר כדי להסיר את מדיום ההטבעה.

טפל עם חוצץ חוסם חדירות כדי לחלחל את ממברנות התאים ולהסוות אתרי קשירה לא ספציפיים. יש לשטוף כדי להסיר עודפי חיץ.

דגירה עם קוקטייל נוגדנים ראשוני המכוון לקולטנים. יש לשטוף כדי להסיר נוגדנים לא קשורים.

דגירה עם נוגדנים משניים שונים המסומנים בפלואורופור הנקשרים לנוגדנים הראשוניים. יש לשטוף כדי להסיר נוגדנים לא קשורים.

הוסף צבע קושר DNA פלואורסצנטי כדי לסמן את הגרעין. לאחר מכן, יש למרוח מדיום הרכבה ולאטום את החלקים בעזרת כיסוי.

באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי, זהה את הקרינה של הנוגדנים. לוקליזציה מוגברת של הנוגדנים בדגי זברה DIO בהשוואה לביקורת מצביעה על הטרומריזציה גבוהה יותר של הקולטנים.

ראשית, יש לשטוף את החלקים שלוש פעמים למשך 5 דקות כל אחד עם מאגר פוספט מולארי 0.1. הוסף את תערובת הנוגדנים הראשוניים ללוטטיום PBT, ודגר את החלקים למשך הלילה בקופסה לחה בטמפרטורת החדר. למחרת יש לשטוף את החלקים שלוש פעמים למשך 5 דקות כל אחד עם מאגר פוספט מולארי 0.1. דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעתיים בתערובת מתאימה של נוגדנים משניים מדוללים ב-PBT.

שוטפים את החלקים שלוש פעמים למשך 5 דקות כל אחד עם 0.1 מאגר פוספט מולרי. ממיסים 1.5 מיקרוליטר DAPI ב-3 מיליליטר של מאגר פוספט להכנת הצבע הגרעיני DAPI. כתם את החלקים בצבע, ולאחר מכן השתמש במדיום הרכבה כדי לכסות את השקופיות כדי לייצב את הרקמה והכתם לשימוש ארוך טווח. ניתן לאחסן דגימות פלורסנט בחושך בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.