אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
מדעי המוח
0 צפיות • 3:13 דק׳ • July 8th, 2025
קח תרביות מיקרו-איים של נוירוני דופמין עובריים ראשוניים של עכברים בצלחת מרובת בארות המכילה מדיה.
נוירונים אלה מטופלים מראש בסיבים שנוצרו מראש (PFFs) - צורות לא מקופלות ומצטברות של חלבון אלפא-סינוקלאין.
PFFs פועלים כזרעים, וגורמים לקיפול שגוי נוסף ואוליגומריזציה של אלפא-סינוקלאין אנדוגני, ויוצרים סיבי אלפא-סינוקלאין זרחניים. סיבים אלה יוצרים בסופו של דבר גופי לוי.
החלף את המדיה בקיבוע כדי לשמר את המורפולוגיה התאית.
שוטפים את התאים עם מאגר.
הכניסו מאגר המכיל חומר ניקוי כדי לחלחל את קרומי התאים.
הוסף תמיסת חסימה כדי למנוע קשירת נוגדנים לא ספציפיים.
הוסף נוגדנים ראשוניים המכוונים לאלפא-סינוקלאין זרחני וחלבון ייחוס המתבטא בכל מקום בתאי עצב של דופמין.
יש לשטוף כדי להסיר נוגדנים לא קשורים.
הציגו נוגדנים משניים מצומדים פלואורופור המכוונים לנוגדנים הראשוניים המתאימים.
יש לשטוף שוב כדי להסיר נוגדנים לא קשורים.
הוסף צבע קושר DNA כדי לצבוע את הגרעינים.
בעזרת סורק צלחות פלואורסצנטיות, כמת את נוירוני הדופמין המכילים אגרגטים אלפא-סינוקלאין ציטופלזמיים.
הוסף 3.75 מיקרוליטר של 100 מיקרוגרם למיליליטר של סיבים שנוצרו מראש לכל באר ניסוי, ו-3.75 מיקרוליטר PBS לכל באר בקרה.
כשאתה עובד עם PFF, היזהר מזיהום החלבון הלא רצוי ולאחר מכן, נקה את מכסה המנוע ואת כל המכשירים הקשורים ל-PFF עם 1% SDS ו-70% אתנול.
בנקודת הסיום הניסויית המתאימה, לאחר צביעה לסמנים המעניינים, טען את לוחית תרבית 96 הבאר על סורק צלחת בעל תכולה גבוהה, המצויד במטרה פי 10. התאם את ההגדרות בהתאם למפרט של צלחת 96 הבארות, כגון סוג הצלחת, היצרן, הגודל, המרחק בין הבארות וסוג ונפח המדיום.
בחר את אזור ההדמיה של הבארות כדי לכסות את כל התאים בכל מיקרו אי, והשתמש בבאר אחת כדי להתאים את המיקוד האוטומטי בביטוי DAPI. כייל את זמן הרכישה עבור כל תעלה פלואורסצנטית, בהתבסס על עוצמת הצביעה בבארות הבקרה, והתאם את הפרמטרים כך שתאי הדופמין בבארות הבקרה המטופלות בסיבים שהוכנו מראש, המכילים אגרגטים של פוספוסרין 129 אלפא סינוקלאין בתוך סומת התא, יובחנו בבירור, ויאפשרו כימות חד משמעי של התאים החיוביים והשליליים של פוספוסרין אלפא סינוקלאין.
לאחר מכן, דמיין את כל הבארות שנבחרו בו זמנית בכל הערוצים, תוך שימוש באותם פרמטרים בדיוק עבור כל באר.