חקר הצטברות אלפא-סינוקלאין בתאי עצב דופמין עובריים ראשוניים

קח תרביות מיקרו-איים של נוירוני דופמין עובריים ראשוניים של עכברים בצלחת מרובת בארות המכילה מדיה.

נוירונים אלה מטופלים מראש בסיבים שנוצרו מראש (PFFs) - צורות לא מקופלות ומצטברות של חלבון אלפא-סינוקלאין.

PFFs פועלים כזרעים, וגורמים לקיפול שגוי נוסף ואוליגומריזציה של אלפא-סינוקלאין אנדוגני, ויוצרים סיבי אלפא-סינוקלאין זרחניים. סיבים אלה יוצרים בסופו של דבר גופי לוי.

החלף את המדיה בקיבוע כדי לשמר את המורפולוגיה התאית.

שוטפים את התאים עם מאגר.

הכניסו מאגר המכיל חומר ניקוי כדי לחלחל את קרומי התאים.

הוסף תמיסת חסימה כדי למנוע קשירת נוגדנים לא ספציפיים.

הוסף נוגדנים ראשוניים המכוונים לאלפא-סינוקלאין זרחני וחלבון ייחוס המתבטא בכל מקום בתאי עצב של דופמין.

יש לשטוף כדי להסיר נוגדנים לא קשורים.

הציגו נוגדנים משניים מצומדים פלואורופור המכוונים לנוגדנים הראשוניים המתאימים.

יש לשטוף שוב כדי להסיר נוגדנים לא קשורים.

הוסף צבע קושר DNA כדי לצבוע את הגרעינים.

בעזרת סורק צלחות פלואורסצנטיות, כמת את נוירוני הדופמין המכילים אגרגטים אלפא-סינוקלאין ציטופלזמיים.

הוסף 3.75 מיקרוליטר של 100 מיקרוגרם למיליליטר של סיבים שנוצרו מראש לכל באר ניסוי, ו-3.75 מיקרוליטר PBS לכל באר בקרה.

כשאתה עובד עם PFF, היזהר מזיהום החלבון הלא רצוי ולאחר מכן, נקה את מכסה המנוע ואת כל המכשירים הקשורים ל-PFF עם 1% SDS ו-70% אתנול.

ב