צביעה חיסונית של אינטרנוירונים בקטע היפוקמפוס של חולדה

קח קטע היפוקמפוס קבוע של חולדה המכיל תא עצב פנימי מלא בביוציטין, מולקולה מצומדת ביוטין.

לאחר מכן, הוסף תמיסה המכילה חלבונים חוסמים וחומר ניקוי לא יוני כדי למנוע קשירה לא ספציפית וחדירת נוירונים.

דגירה עם נוגדן ראשוני המכוון לקולטני קנבינואידים ספציפיים על אינטרנוירונים.

יש לשטוף עם חוצץ כדי להסיר עודפי נוגדנים.

לאחר מכן, הוסף צבע פלואורסצנטי מצומד סטרפטווידין ונוגדנים משניים מצומדים פלואורופור.

במהלך הדגירה, סטרפטווידין נקשר חזק לביוציטין, ומאפשר הדמיה של האינטרנוירון המלא בביוציטין, בעוד שהנוגדן המשני מכוון לנוגדנים ראשוניים הקשורים לקולטן על האינטרנוירונים.

שוטפים עם חיץ, מסירים מולקולות לא קשורות.

כעת, הרכיב את הקטע באמצעות אמצעי הרכבה מימיים. מקם כיסוי ואטום אותו.

באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, דמיין את ביטוי האינטרנוירונים והקולטנים הקנבינואידים המלאים בביוציטין, המאפשר ניתוח של המורפולוגיה והתפלגות הקולטן של האינטרנוירון.

יש לנעול את הטישו עם סרום חוסם של 10% למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, דגרו את החלקים בנוגדנים ראשוניים CB1R בטמפרטורת החדר למשך הלילה, כדי לזהות ביטוי קולטן קנבינואידים מסוג 1. לאחר מכן, שטפו את חלקי המוח שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחד ב-0.1 PBS מולארי. סטרפטווידין ונוגדנים משניים לנוגדנים ראשוניים ראשוניים, מתווספים שניהם לצלחת הבאר ונשמרים למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, דגרו את החלקים בצבע אדום סטרפטווידין מצומדים בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה בחושך כדי לחשוף את הביוציטין. לאחר מכן, שטפו את חלקי המוח שלוש פעמים למשך 10 דקות כל אחד ב-0.1 PBS מולארי. כדי להגן על הקרינה ולהקל על צביעה מחדש בעתיד, הרכיבו את החלקים במדיום הרכבה על בסיס מימי, ואטמו את שולי הכיסויים עם לק שקוף.