אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
מדעי המוח
0 צפיות • 3:02 דק׳ • July 8th, 2025
קח קטעי ביופסיה קבועים של יניקה רקטלית אנושית עם אנטיגנים חלבונים חשופים ופרוקסידאזות אנדוגניות מומתות.
הוסף תמיסת חסימה כדי למנוע קשירת נוגדנים לא ספציפיים.
החלף את תמיסת החסימה בנוגדנים ראשוניים הנקשרים לחלבון תאי גליה המטרה, S-100, סמן למחלת הירשפרונג.
הסר נוגדנים לא קשורים ודגר עם פולימרים פרוקסידאז כדי להגביר את האות.
שוטפים כדי להסיר עודפי פולימר. הוסף נוגדנים משניים הנקשרים לפולימרים אנזימים ונוגדנים ראשוניים.
הסר נוגדנים לא קשורים והוסף מצע כרומוגני.
הפרוקסידאזות מגיבות עם המצע ויוצרות משקעים צבעוניים.
יש לשטוף כדי להסיר עודפי משקעים.
הוסף צבע כדי להכתים את הגרעינים.
שוטפים בתמיסת חומצה-אתנול להסרת עודפי צבע.
לאחר מכן, יבש את החלקים באמצעות ריכוזים הולכים וגדלים של אתנול ואחריו קסילן.
לבסוף, הרכיבו והתבוננו תחת מיקרוסקופ כדי לדמיין את הצביעה המצביעה על נוכחות חלבון המטרה.
השליכו את עודפי האלבומין בסרום בקר, וסמנו את התאים ב-50 מיקרוליטר של הנוגדן העיקרי המעניין ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת בבוקר, שטפו את השקופיות בשלוש שטיפות של שלוש דקות ב-PBS והוסיפו 50 מיקרוליטר של משפר פולימר לכל שקופית. לאחר 20 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, שטפו את השקופיות שלוש פעמים ב-PBS, והוסיפו 50 מיקרוליטר של נוגדן B משני לכל קטע רקמה.
לאחר 30 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס, שטפו את החלקים בשלוש שטיפות של חמש דקות ב-PBS, והוסיפו טיפה של תמיסת עבודה DAB טרייה לכל שקופית. כאשר הרמה המתאימה של כתמים חומים מזוהה על ידי מיקרוסקופ אור, שטפו את השקופיות ב-PBS למשך חמש דקות, וצבעו את הגרעינים בטיפה אחת של המטוקסילין למשך דקה אחת.
הסר את הכתם העודף מתחת לטפטוף מים למשך כ-30 עד 40 שניות, ולאחר מכן שטיפה של 25 עד 30 שניות ב-PBS טרי. הבדיל את הרקמות באתנול חומצה הידרוכלורית 1% למשך 10 שניות, ולאחר מכן שטיפת PBS של דקה.
ייבשו את המגלשות עם טבילה של חמש דקות בסדר הפוך של הידרציה, וחשפו את המגלשות לשני החלפות של חמש דקות של קסילן. לאחר מכן, הרכיבו את הכיסוי באמצעות הרכבה נקייה במיוחד, ואפשרו לשקופיות להתייבש לפני ההדמיה שלהן במיקרוסקופ אור.