מדידת פרמטרים מיטוכונדריאלים מרובים בתאי עצב באמצעות זרימה ציטומטרית

קח נוירונים קבועים וחדירים בצינור.

הוסף מאגר חוסם כדי למנוע קשירת נוגדנים לא ספציפיים.

צנטריפוגה את המתלה והסר את הסופרנטנט. לאחר מכן, השעו מחדש את הנוירונים במאגר.

העבירו את התרחיף באופן שווה לצינורות המכילים נוגדנים ראשוניים לא מתויגים ומתויגים פלואורופור.

דגירה, המאפשרת לנוגדנים להיקשר באופן ספציפי לשרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית או לתת-יחידות מורכבות MRC, חלבון הקשור ל-DNA מיטוכונדריאלי וחלבון ממברנה חיצונית מיטוכונדריאלית בתוך הנוירונים.

הסר את כל הנוגדנים הלא קשורים.

דגירה עם נוגדנים משניים מתויגים פלואורופור הנקשרים לנוגדנים הראשוניים הלא מתויגים.

צנטריפוגה את התערובת והשליכו את הסופרנטנט.

השעו מחדש את הנוירונים במאגר והעבירו אותם לצינורות מיקרו-צנטריפוגה.

בצע ציטומטריית זרימה כדי לזהות את האותות הפלואורסצנטיים על הנוירונים המסומנים המתאימים לרמות הביטוי של תת-יחידות מורכבות MRC ולמדידת רמות ה-DNA המיטוכונדריאליות היחסיות.

חסום את הדגימות במיליליטר אחד של מאגר חוסם, ושטוף את התאים על ידי צנטריפוגה עם PBS כפי שהודגם. כדי לזהות קומפלקסים ותת-יחידות מיטוכונדריאליות שונות, דגרו על התאים למשך 30 דקות עם הנוגדנים העיקריים המתאימים המתוארים בכתב היד הטקסטואלי. לאחר שטיפת התאים פעם אחת עם PBS, דגרו את התאים עם נוגדן משני למשך 30 דקות.

בתום הדגירה יש לשטוף ולהשעות מחדש את התאים ב-PBS כפי שהודגם. העבירו את תרחיף התא לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר, שנשמר בחושך, על קרח. לאחר מכן, נתח את התאים על ציטומטר הזרימה וזהה אותות וסנן אחד באמצעות מסנן פס פס 530/30.