אימונוהיסטוכימיה לזיהוי אזור ה-locus coeruleus בחלקי מוח של עכברים

אזורי ה-locus coeruleus, הממוקמים באופן דו-צדדי בגזע המוח של העכבר, מכילים נוירונים המייצרים נוראדרנלין ומווסתים אזורים שונים ברחבי המוח.

כדי לזהות את אזורי ה-locus coeruleus הללו, התחל עם מגלשת זכוכית הנושאת את חלקי גזע המוח של העכבר הקבועים והשמורים.

שטפו את השקופית עם מאגר כדי להסיר עקבות קיבוע.

הוסף חיץ המכיל חומר ניקוי ודגר כדי לחדור את הממברנות, ואז לשטוף.

הציגו נוגדנים ראשוניים ספציפיים לאנזים דופמין β-הידרוקסילאז, הממיר דופמין לנוראדרנלין, מוליך עצבי.

דגירה כדי לאפשר לנוגדנים לקיים אינטראקציה עם דופמין β-הידרוקסילאז.

יש לשטוף כדי להסיר נוגדנים לא קשורים.

לאחר מכן, הוסיפו נוגדנים משניים ירוקים המצומדים לפלואורופור ודגרו בחושך.

הנוגדנים המשניים נקשרים לנוגדנים הראשוניים ואז שוטפים.

הוסף מדיום הרכבה לחלקי המוח, ואז כסה וייבש.

התבונן בשקופיות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

הקרינה הירוקה המייצגת את הנוירונים המייצרים נוראדרנלין המסומנים בקטעי המוח מצביעה על נוכחות של אזורי locus coeruleus.

ביום הראשון יש לשטוף את פרוסות המוח בצלחת 24 בארות 3 פעמים למשך 5 דקות כל אחת ב- PBS. לאחר מכן, הוסיפו 0.5% PBS עם חומר ניקוי, וחודרו אותם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.

למחרת יש לשטוף את הפרוסות שלוש פעמים למשך 5 דקות כל אחת עם 0.5% PBSD. לאחר מכן, הוסיפו את הנוגדן העיקרי בדילול של 1 עד 500 ב-0.5% PBSD, ודגרו ב-4 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות.

ביום השלישי יש לשטוף את הפרוסות 3 פעמים למשך 10 דקות כל אחת עם 0.5% PBSD. לאחר מכן, הוסף את הנוגדן המשני בדילול של 1 עד 1,000 ב-0.5% PBSD. עוטפים את הצלחת בנייר אלומיניום ומדגרים בחום של 4 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות.

לאחר הדגירה יש לשטוף את הפרוסות 3 פעמים למשך 5 דקות כל אחת עם 0.5% PBSD, ואז למשך 5 דקות ב- PBS. כסה את החלקים באמצעות אמצעי הרכבה קשיח ללא DAPI. מכסים במכסה זכוכית ומייבשים 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי עם הגדרות כדי לזהות אות מאורך גל פלואורסצנטי מתאים, כדי לדמות פרוסות מוח.