אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
מדעי המוח
0 צפיות • 6:31 דק׳ • July 8th, 2025
קצור את רקמת הבולטות הגנגליונית המדיאלית, המכילה אבות בין-עצביים בקליפת המוח, מעוברי עכברים מהונדסים גנטית.
הוסף פולימר קטיוני ופרק את הרקמה לתרחיף חד-תאי.
הוסף וקטורים לנטי-ויראליים הנושאים מדווח GFP תלוי Cre recombinase המוקף באתרי לוקס. דגירה.
הפולימר מנטרל את המטענים הוויראליים וקרום התא המארח, ומאפשר היתוך ויראלי ושחרור RNA.
ה-RNA הנגיפי עובר העתקה הפוכה ומשולב בגנום המארח.
צנטריפוגה והשליכו את הסופרנטנט. לספוג עודפי מדיה.
העבירו את התאים למשטח הידרופובי והעמיסו אותם למכשיר הזרקה.
הזריקו את התאים לקליפת המוח של גור עכבר מורדם.
אפשרו לגור להתאושש ולגדול.
האבות המושתלים מתמיינים לתאי עצב בוגרים בקליפת המוח.
תת-קבוצה של אינטרנוירונים אלה מבטאת במשותף Cre recombinase ו-RFP.
באינטרנוירונים אלה, Cre כורת את אתרי הלוקס, הופך את הגן GFP ומאפשר את ביטויו.
דמיין את הביטוי המשותף של RFP ו-GFP כדי לזהות אינטרנוירונים המבטאים Cre.
לאחר הכנת ה-lentivirus וניתוח ה-MGE לפי ההוראות בפרוטוקול הכתוב, אספו את שתי ההמיספרות של ה-MGE והכניסו את הרקמה לשני צינורות איסוף של 1.5 מיליליטר המכילים 500 מיקרוליטר של DMEM עם 10% FBS.
שמור את הדגימות על קרח עד שכל הרקמות נאספות. לאחר מכן העבירו את הצינורות למכסה מנוע מוסמך BSL-2. שאפו בזהירות את המדיה מבלי להפריע לרקמות ה-MGE המונחות בתחתית הצינור.
לאחר מכן הוסף כ-500 מיקרוליטר של DMEM מחומם מראש עם 10% מדיה FBS. הוסף פוליברן לריכוז סופי של 8 מיקרוגרם למיליליטר, וטרטר דרך קצה פיפטה P1000 עד להשגת תרחיף של תא יחיד. לאחר מכן, הוסף 15 עד 20 מיקרוליטר של נגיף הלנטי המרוכז לכל צינור.
לאחר מכן, סגור היטב כל צינור, הפוך לערבוב ולאחר מכן הנח את כל הצינורות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס. דגרו על התאים עם נגיף הלנטי למשך 30 דקות לפחות, אך לא יותר משעה, מכיוון שזמנים ארוכים יותר הביאו לירידה בכדאיות התאים. הפוך את הצינורות כל 10 דקות.
לאחר הדגירה, הוציאו את הצינורות מהחממה, וצנטריפוגה ב-700 פעמים גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות כדי לגלול את התאים. במכסה המנוע BSL-2, הסר את הסופרנטנט והשליך לאקונומיקה של 10%. לאחר מכן, הוסף 1 מיליליטר של DMEM עם 10% FBS, וטיטר את הגלולה פעמיים עד שלוש כדי לשטוף.
לאחר צנטריפוגה כמו קודם, חזור על שלב שטיפה זה פעמיים-שלוש נוספות כדי להסיר עודפי נגיף. לאחר הכביסה הסופית, הסר כמה שיותר מדיה, והניח כל צינור על קרח.
עקב שאריות מדיה בצידי הצינור, כ-2 עד 3 מיקרוליטר של מדיה יכסו בסופו של דבר את גלולת התא, עד שהליך ההשתלה יתחיל. תוך הקפדה על שימוש בטכניקה סטרילית לאורך כל הדרך, שאב שמן מינרלי למזרק של 1 מיליליטר, ולאחר מכן בעזרת מחט בגודל 30.5, מלא מחדש את פיפטת הזכוכית לחלוטין בשמן המינרלי.
לאחר מכן, חבר את פיפטת הזכוכית למכשיר הסטריאוטקסי והעמיס על הבוכנה. בעזרת עוזר המשתמש בכונן ההידראולי, הזיזו את הבוכנה בערך באמצע הדרך לתוך פיפטת הזכוכית, והסירו את השמן המינרלי שנשפך החוצה בעזרת מגבת נייר נקייה.
לאחר מכן, סובב את הפינה של מגבת נייר סטרילית לנקודה דקה, והשתמש בה כדי להסיר בעדינות עודפי מדיה מעל גלולת תא ה-MGE. זה ירכז את צפיפות התאים כך שניתן יהיה להשיג נפחי הזרקה קטנים יותר.
לאחר מכן, השתמש בפיפטה P2 כדי למשוך לאט את כדור התא ולטטר פעם עד פעמיים לפני הוצאה על משטח הידרופובי. הנפח צריך להיות קצת פחות מ-1 מיקרוליטר.
העבר את קצה המחט לתוך מתלה התא, ובעזרת הכונן ההידראולי, משוך את מתלה התא לתוך הפיפטה. לאחר הרדמת גור באמצעות היפותרמיה, בדקו את יעילות ההרדמה על ידי צביטת העור בין אצבעות הרגליים בעזרת מלקחיים. אין לראות שום תגובה.
לאחר מכן, הניחו את הגור על תבנית שנמצאת מתחת למכשיר ההזרקה, והפכו את העור למתוח על ידי משיכת העור לאחור על הראש ולאחר מכן אבטחתו עם סרט מעבדה סטנדרטי. עבדו במהירות, תפעל את הזרוע הסטריאוטקסית כדי למקם את קצה פיפטת הזכוכית על ראשו של הגור, בניצב לפני השטח של הראש.
כאשר הפיפטה נמצאת במגע עם הראש, קחו בחשבון שזה אפס. לאחר מכן, דחפו את הפיפטה דרך פני העור והגולגולת לתוך קליפת המוח. לאחר מכן, הכנס ומשוך את הפיפטה פעמיים לפני העצירה.
למיקוד תאים לתוך הניאו-קורטקס, הזרקות מבוצעות כאשר המיקרופיפטה נמצאת בעומק של 0.1 מילימטר. לאחר שהמחט במקומה, סובב את המכשיר ההידראולי כדי לקדם את הבוכנה לתוך פיפטת הזכוכית, והזריק 50 עד 70 ננוליטר לכל אתר.
חזור על הליך זה בשלושה עד שישה אתרים שונים ברמות רוסטרליות-זנביות שונות אם נדרשת התפלגות רחבה של תאים שעברו טרנספורמציה ברחבי הניאו-קורטקס. בסיום ההזרקות יש להוציא את הגור מהבמה ולסמן אותו בהתאם לנהלים המאושרים.
לאחר שהגור התאושש ומסוגל לנוע בכוחות עצמו, החזירו אותו עם הנקבה המניקה ושאר ההמלטה. בדקו את הגורים לאחר ההליך ולמחרת, כדי לוודא שאין סימנים להידרדרות בבריאותם.