גירוי של נוירונים חושיים של גנגליון שורש הגב באמצעות אגוניסט לקולטן נוירופפטיד

קח צלחת מרובת בארות המכילה נוירונים חושיים של גנגליון שורש גב של חולדה.

נוירוני באר הבדיקה מציגים ביטוי מופחת של קולטן נוירופפטיד, בעוד שנוירוני באר הבקרה מציגים רמות פיזיולוגיות של ביטוי קולטן נוירופפטיד.

החלף את המדיה במדיה נטולת סרום כדי לספק סביבה מבוקרת לתגובה מדויקת לגירוי.

הוסף אגוניסט לקולטן נוירופפטיד לבארות וערבב. דגרו את הצלחת.

בבאר הבקרה, אגוניסט הקולטן הנוירופפטידי נקשר לקולטני המטרה, ומפעיל מפל איתות תוך-תאי המשחרר נוירוטרנסמיטורים.

עם זאת, בבארות הבדיקה, ביטוי מופחת של קולטן נוירופפטיד מגביל את קשירת האגוניסטים, מה שמוביל לירידה בשחרור נוירוטרנסמיטורים בהשוואה לביקורת.

לאחר הדגירה אוספים את המדיה מהבארות והצנטריפוגה.

העבירו את הסופרנטנט לתוך צינורות והשתמשו בבדיקה חיסונית מתאימה כדי למדוד את רמות המוליכים העצביים. דגימת הבקרה מציגה שחרור נוירוטרנסמיטר גבוה יותר מאשר דגימת הבדיקה לאחר גירוי אגוניסט של קולטני עצב.

ביום 6, לאחר הציפוי ו-72 שעות לאחר העברת siRNA, שנה את מדיום התרבות ל-200 מיקרוליטר של מדיום נטול סרום. לאחר דגירה של 30 דקות, הוסיפו מיקרוליטר אחד של הכימיקל המעורר, וערבבו בעדינות על ידי פיפטינג. לאחר הדגירה לתקופה הנדרשת, אוספים את מדיום התרבות מכלי התרבות, וצנטריפוגה ב -5,000 פעמים גרם למשך 5 דקות ב -4 מעלות צלזיוס כדי להסיר זיהומים תלויים. אוספים את הסופרנטנט מהצנטריפוגה, ומדללים במי מלח עם חוצץ פוספט לפי הצורך.