אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
מדעי המוח
0 צפיות • 2:58 דק׳ • July 8th, 2025
קחו קטע קבוע במוח העכבר המכיל את הגרעין הבסיסי של מיינרט, עשיר בסיבי עצב המבטאים את האנזים כולין אצטילטרנספראז.
הקטע מטופל מראש כדי לנטרל פרוקסידאז אנדוגני.
הוסיפו חומר ניקוי כדי לחלחל את קרומי התאים, ואחריו תמיסת חסימה כדי למנוע קשירת נוגדנים לא ספציפיים.
החלף את התמיסה בנוגדנים ראשוניים הנקשרים לכולין אצטילטרנספראז.
יש לשטוף עם חוצץ כדי להסיר נוגדנים לא קשורים. דגירה עם נוגדנים משניים מתויגים ביוטין, הנקשרים לנוגדנים הראשוניים.
הסר נוגדנים לא קשורים והוסף קומפלקסים של אבידין-ביוטין-פרוקסידאז, הנקשרים לנוגדנים המשניים.
יש לשטוף כדי להסיר מתחמים עודפים.
הוסף מצע כרומוגני המגיב עם פרוקסידאז ויוצר משקע צבעוני.
שוטפים במים מזוקקים כדי להסיר עודפי משקעים.
העבירו את הקטע לשקופית ג'לטינית.
לאחר מכן, יבש את הקטע באמצעות הגדלת ריכוזי האתנול, ואחריו קסילן.
הרכיב את הקטע והתבונן תחת מיקרוסקופ כדי לדמיין את סיבי העצב המוכתמים.
לתיוג אימונוהיסטוכימי של קטעי הרקמה, לאחר חסימת כל קשירה לא ספציפית עם 10% סרום בקר רגיל ב-0.1% Triton X-100, בתמיסת מלח עם טריס-בופר, סמן את החלקים עם הנוגדן העיקרי המבוקש, למשך 48 שעות בארבע מעלות צלזיוס.
בתום הדגירה יש לשטוף את החלקים שלוש פעמים, למשך שלוש דקות, במי מלח טריים עם טריס בכל שטיפה. לאחר מכן הדגירה עם נוגדן משני ביוטיניל מתאים, למשך שעה בטמפרטורת החדר.
בתום הדגירה יש לשטוף את החלקים שלוש פעמים במי מלח טריים, כפי שהודגם. לאחר מכן צביעה עם קומפלקס אבידין-ביוטין-פרוקסידאז ותמיסת מצע DAB פרוקסידאז, על פי פרוטוקולי היצרן.
לאחר הכביסה, הרכיבו את כל החלקים מדגימת רקמת מוח אחת על שקופית ג'לטין אחת. הניחו לדגימות להתייבש באוויר. כדי לייבש את החלקים, טבלו את הדגימות פעמיים, למשך חמש דקות לכל דילול, בתמיסות אתנול עולות ברצף, כפי שצוין, ולאחר מכן ניקוי עם שתי שטיפות קסילן של 10 דקות. לאחר מכן, השתמש באמצעי הרכבה מתאים כדי להניח כיסויים על המגלשות.