מדידת ספיגת דופמין בסינפטוזומים במוח עכבר באמצעות דופמין עם תווית רדיו

קצור סינפטוזומים, מבנים הקשורים לממברנה שמקורם במסופים הפרה-סינפטיים השלמים של סינפסות עצביות המכילות מובילי דופמין (DAT), ממוח עכבר.

מלאו מבחנות במאגר המכיל ליגנדים ומבחנות ייחוס עם מאגר המכיל ליגנדים ומעכב DAT.

הוסף את הסינפטוזומים.

הליגנדים מעכבים אנזימים מפרקי דופמין וטרנספורטרים אחרים, ומונעים פירוק דופמין וספיגה לא ספציפית.

הציגו דופמין ללא תווית ועם תווית רדיו.

בתנאי הבדיקה, DAT סינפטוזומלי לוקח את הדופמין.

בתנאי הייחוס, המעכב מונע ספיגת דופמין בתיווך DAT, ומאפשר ספיגת רקע בלבד.

הוסף את הדגימות למסנני מיקרופייבר השומרים על הסינפטוזומים.

שטפו כדי להסיר דופמין לא קשור.

מעבירים את המסננים לצינורות נצנוץ.

הוסף נוזל נצנוץ המכיל תרכובת רגישה לקרינה.

הניחו את הצינורות בדלפק נצנוץ.

פליטות רדיואקטיביות מדופמין מעוררות את התרכובת לפלוט אור, הנמדד על ידי המונה.

הפחת את ההפניה מנתוני הבדיקה כדי למדוד את ספיגת הדופמין הסינפטוזומלי.

בשלב זה, הוסף 440 מיקרוליטר של מאגר קליטה, ליגנד וקוקאין ל-12 צינורות מיקרו-צנטריפוגה ייעודיים של 1.5 מיליליטר, ו-440 מיקרוליטר של מאגר קליטה וליגנד ל-36 צינורות המיקרו-צנטריפוגה הנותרים של 1.5 מיליליטר. סמן 6 צינורות מיקרו-צנטריפוגה של 2 מיליליטר כ-10, 5, 2.5, 1.25, 0.62 ו-0.31. לאחר מכן הוסף 750 מיקרוליטר של מאגר קליטה וליגנד ל-5 צינורות המיקרו-צנטריפוגה עם המספר הנמוך ביותר.

לאחר מכן, הוסף 1,455.4 מיקרוליטר של מאגר קליטה וליגנד, 14.6 מיקרוליטר של דופמין ללא תווית ו-30 מיקרוליטר של דופמין משולש לצינור המסומן 10. לאחר מכן, העבירו 750 מיקרוליטר מהתערובת מהצינור המסומן 10 לצינור המסומן 5. מערבבים היטב, ומעבירים 750 מיקרוליטר מהתערובת מהצינור הזה לצינור המסומן 2.5. חזור על דילול זה עם הצינורות הנותרים.

לאחר מכן, יש לשטוף מראש את מסנני המיקרופייבר מזכוכית עם 4 מיליליטר מאגר קליטה לאחר הנחתם על דלי סינון של 12 בארות. לאחר מכן, הוסף 10 מיקרוליטר של תרחיף הממברנה הסינפטוזומלית ל-24 צינורות המיקרו-צנטריפוגה הראשונים בנפח 1.5 מיליליטר המכילים מאגר של 440 מיקרוליטר. מערבולת בזהירות, וסובב תוך זמן קצר כדי להבטיח שהסינפטוזומים שקועים במאגר.

לאחר מכן, השאירו אותם בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר 10 דקות, הוסיפו 50 מיקרוליטר דופמין של 10 מיקרומולר ו -5 מיקרומולר ל -2 העמודות הראשונות, והשאירו אותם על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות עם ניעור. לאחר 5 דקות, עצור את התגובה על ידי הוספת 1 מיליליטר של מאגר ספיגת קרח קר. חזור על זה עם 2.5 מיקרומולר ו-1.25 מיקרומולר, ולאחר מכן עם 0.62 מיקרומולר ו-0.31 מיקרומולר.

הוסף את הדגימות למסנני המיקרופייבר השטופים מראש, ושטוף אותם עם 5 x 4 מיליליטר של מאגר ספיגה קר כקרח. לאחר הוספת 12 הדגימות הראשונות למסננים, העבר את המסננים לצינורות הנצנוץ. חזור על כך עם 12 הדוגמאות הבאות. הכן 3 צינורות ספירה מקסימליים על ידי הנחת מסנן מיקרופייבר בתחתית צינורות הנצנוץ 49 עד 51, והוספת 25 מיקרוליטר מהדופמין המרבי של 10 מיקרומולר מעל.

לאחר מכן, השאירו את כל 51 צינורות הנצנוץ במכסה אדים למשך שעה. לאחר מכן, הוסיפו 3 מיליליטר נוזל נצנוץ לכל צינור נצנוץ, ונערו במרץ על שייקר למשך שעה. כדי לספור דופמין משולש במונה בטא למשך דקה אחת, פתח את התוכנית ובחר את ההגדרות המתאימות. לקביעת חלבון, השתמש בערכת בדיקת חלבון BCA סטנדרטית כדי לקבוע את ריכוזי החלבון של הסינפטוזומים לצורך התאמות, ולהשוואה נכונה של ספיגה בין דגימות.