תיוג של אינטרנוירונים מלאים בביוציטין בפרוסות היפוקמפוס של חולדות לצורך הדמיה

קח פרוסות היפוקמפוס של חולדות קבועות וחדירות המכילות אינטרנוירונים מלאים בביוציטין עם פרוקסידאזות אנדוגניות מושבתות.

הוסיפו קומפלקסים של אבידין-ביוטין (ABC) המכילים פרוקסידאז חזרת (HRP) ודגרו, מה שמאפשר לאווידין להיקשר לביוציטין.

שטפו את ABC ללא גבולות.

הוסף תערובת של מצע כרומוגני ומשפר מתכת, ואז דגירה.

הכניסו מי חמצן להפעלת ה-HRP, המחמצן את המצע ליצירת משקעים כהים, בעוד המשפר משפר את הניגודיות.

מעבירים את הפרוסות לנייר סינון ומסירים עודפי חיץ. טפל באוסמיום טטרוקסיד כדי לשפר את הניגודיות.

הניחו את הפרוסות על שקופית והרכיבו. יבש אותם באמצעות הגדלת ריכוזי האתנול.

שוטפים את הפרוסות באתנול מוחלט ותחמוצת פרופילן.

הוסף שרף כדי לחדור לרקמות.

מניחים את הפרוסות בפלנצ'ט ומחממים לפילמור השרף. מעבירים את הפרוסות לשקופית, מניחים כיסוי וממצקים את השרף.

באמצעות מיקרוסקופ אור, דמיינו את האינטרנוירונים המלאים בביוציטין המוכתמים כהה.

הנח את החלקים בבקבוקון זכוכית נקי המכיל PBS. בצע את תגובת ה-HRP של אבידין על ידי דגירה ראשונה של החלקים בקומפלקס ביוטין אבידין, או ABC, למשך שעתיים לפחות כדי להגביר את תוצר תגובת ה-HRP.

לאחר מכן, שטפו את החלקים עם PBS 3 פעמים למשך 10 דקות, ולאחר מכן עם Tris buffer פעמיים למשך 10 דקות. לאחר הסרת שטיפת מאגר העקבות האחרונה, הוסף במהירות טיפה אחת של תמיסת ניקל כלוריד 8% לתמיסת הדיאמינובנזידין, או תמיסת DAB. לאחר מכן פיפטה את התמיסה פנימה והחוצה כדי לערבב.

והוסף במהירות 1 מיליליטר של תמיסה זו מעל החלקים. דגרו את החלקים בתמיסה זו למשך 15 דקות. לאחר מכן, הוסף 10 מיקרוליטר של מי חמצן 1% לתמיסת DAB. אפשר לתגובה להמשיך בחושך תחת תסיסה מתמדת למשך כ-1 עד 2 דקות, עד שהתאים מסומנים.

במכסה אדים, הניחו עיגול קטן של נייר פילטר בצלחת פטרי והרטיבו אותו עם PB. הרם את החלקים בזה אחר זה מבקבוקון הזכוכית בעזרת מכחול, והניח אותם בזהירות שטוחים על הנייר. מכסים את החלקים בעיגול לח נוסף של נייר פילטר. והסר את המאגר העודף על ידי נגיעה עדינה בנייר טישו על פני השטח.

מרחו 8 או 9 טיפות של 1% אוסמיום טטרוקסיד ב-PB על הנייר העליון. מכסים את המנה ושומרים במכסה האדים למשך 30 דקות לפחות, אך לא יותר משעה. לאחר שטיפה, הרכבה והחלקת מכסה החלקים, יש לייבש באמצעות סדרה של תמיסות אלכוהול של 50%, 70%, 95% ו-100%.

לאחר שלב ההתייבשות, העבירו את החלקים לבקבוקון זכוכית המכיל 100% אתנול על שייקר למשך כ-5 דקות. החלף את תמיסת האלכוהול בתחמוצת פרופילן, ושטוף שלוש פעמים למשך 5 דקות. לאחר הכביסה האחרונה, שמור בבקבוקון כ -2 מיליליטר תחמוצת פרופילן, והוסף שרף ביחס של אחד לאחד.

ודא שהשרף מומס, ושמור על החלקים בתסיסה מתמדת למשך 30 דקות. לאחר 30 דקות, השתמש במקל עץ כדי להניח כל חלק בפלנצ'ט אלומיניום המכיל שרף אפוקסי ולדגור למשך הלילה. למחרת, הניחו את הפלנצ'ט על צלחת חמה למשך כ -10 דקות.

לאחר מכן, הרם כל חלק בעזרת מקל עץ והניח על מגלשה נקייה. לאחר שכל החלקים הועברו לשקופית, צפה בשקופית תחת מיקרוסקופ מנתח כדי לבדוק את כיוון הפרוסות ולהניח כיסוי מעל החלקים. מרפאים בתנור למשך 48 שעות בחום של 56 מעלות צלזיוס.