תיוג של אינטרנוירונים מלאים בביוציטין בפרוסות היפוקמפוס של חולדות לצורך הדמיה

קח פרוסות היפוקמפוס של חולדות קבועות וחדירות המכילות אינטרנוירונים מלאים בביוציטין עם פרוקסידאזות אנדוגניות מושבתות.

הוסיפו קומפלקסים של אבידין-ביוטין (ABC) המכילים פרוקסידאז חזרת (HRP) ודגרו, מה שמאפשר לאווידין להיקשר לביוציטין.

שטפו את ABC ללא גבולות.

הוסף תערובת של מצע כרומוגני ומשפר מתכת, ואז דגירה.

הכניסו מי חמצן להפעלת ה-HRP, המחמצן את המצע ליצירת משקעים כהים, בעוד המשפר משפר את הניגודיות.

מעבירים את הפרוסות לנייר סינון ומסירים עודפי חיץ. טפל באוסמיום טטרוקסיד כדי לשפר את הניגודיות.

הניחו את הפרוסות על שקופית והרכיבו. יבש אותם באמצעות הגדלת ריכוזי האתנול.

שוטפים את הפרוסות באתנול מוחלט ותחמוצת פרופילן.

הוסף שרף כדי לחדור לרקמות.

מניחים את הפרוסות בפלנצ'ט ומחממים לפילמור השרף. מעבירים את הפרוסות לשקופית, מניחים כיסוי וממצקים את השרף.

באמצעות מיקרוסקופ אור, דמיינו את האינטרנוירונים המלאים בביוציטין המוכתמים כהה.

הנח את החלקים בבקבוקון זכוכית נקי המכיל PBS. בצע את תגובת ה-HRP של אבידין על ידי דגירה ראשונה של החלקים בקומפלקס ביוטין אבידין, או ABC, למשך שעתיים לפחות כדי להגביר את תוצר תגובת ה-HRP.

לאחר מכן, שטפו את החלקים עם PBS 3 פעמים למשך 10 דקות, ולאחר מכן עם Tris buffer פעמיים למשך 10 דקות. לאחר הסרת שטיפת מאגר העקבות האחרונה, הוסף במהירות טיפה אחת של תמיסת ניקל כלוריד 8% לתמ