הכלאה באתרה באמצעות בדיקות אוליגונוקלאוטידים לחקר ביטוי RNA בחלקי מוח של חולדות

קח קטעי מוח קבועים מחולדה עם תסמונת סרוטונין, מה שמוביל לשינוי בסינתזת RNA של קולטן סרוטונין בנוירונים.

ייבשו את הרקמה באמצעות אלכוהול. החל תמיסת טיפול מקדים כדי לנטרל אנזימים הידרוליזה אנדוגניים, ולמנוע את האינטראקציה שלהם עם ריאגנטים לזיהוי.

טפל עם מאגר רותח כדי לשבור קישורים צולבים המושרים על ידי קיבוע, ולחשוף את RNA המטרה.

יבש את הרקמה, צייר מחסום הידרופובי ודגר אותה בתמיסה לחדירת ממברנות התאים.

הוסף בדיקות אוליגונוקלאוטידים ודגר, מה שמאפשר לבדיקות להכלאה עם RNA המטרה.

שטפו כדי להסיר בדיקות לא קשורות, ולאחר מכן דגרו עם ריאגנטים להגברה המכילים בדיקות תווית מצומדות לאנזים, הנקשרות לבדיקות האוליגונוקלאוטיד.

דגירה עם מצעים כרומוגניים שעוברים הידרוליזה על ידי הבדיקות המצומדות לאנזים, ומייצרות צבע גלוי.

טפל בקסילן כדי להגביר את שקיפות הרקמות, הוסף מדיום הרכבה והחל כיסוי.

תחת מיקרוסקופ, כתמים צבעוניים ברקמה עוזרים לכמת את ביטוי ה-RNA המטרה.

בהליך זה, להתייבשות, קח ארבע שקופיות לקופסאות שקופיות מיקרוסקופ המאוחסנות במקפיא שלילי של 80 מעלות צלזיוס. הקצה את הסעיפים לבדיקות של גנים ppiB, dapB ו-ht2a. סמן ותייג אותם בעט כדורי.

לאחר מכן, טבלו את המגלשות ב-100% אלכוהול בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר מכן, יבש את השקופיות במשך חמש דקות במכסה האדים. לטיפול מקדים, פיפטה 20 מיקרוליטר של הטיפול המקדים מגיב אחד לכל חלק.

הנח את המגלשות על מסילת מתלה במגש לחות. יש לנער בעדינות את מגש הלחות על שייקר אופקי במהירות נמוכה למשך 10 דקות. לאחר מכן, שטפו את המגלשות פעמיים במים מזוקקים כפולים למשך שתי דקות. טבלו את השקופיות בכוס של 1,000 מיליליטר המכילה 450 מיליליטר של המגיב לטיפול מקדים 2.

לאחר מכן, הרתיחו את השקופיות למשך חמש דקות בסך הכל בחום של 100 מעלות צלזיוס כדי לשחזר את מבנה ה-RNA. לאחר מכן, שטפו את המגלשות פעמיים במים מזוקקים כפולים למשך שתי דקות בכל פעם. מניחים את השקופיות ב-100% אלכוהול למשך חמש דקות.

לאחר מכן יבש את השקופיות במשך חמש דקות במכסה האדים. השתמש בעט הידרופובי כדי לצייר עיגול סביב האזור שנבחר בקטע הרקמה. לאחר מכן, פיפטה 10 מיקרוליטר של המגיב לטיפול מקדים לכל אזור שנבחר כדי להגביר את חדירת הבדיקה, ולכסות את מגש הלחות במכסה.

לאחר מכן, הכניסו את המגש לתנור ההיברידיזציה המצויד בשייקר אופקי. מכוונים את טמפרטורת התנור ל -40 מעלות צלזיוס ומנערים בעדינות את המגש למשך 30 דקות. לאחר מכן, שטפו את המגלשות פעמיים במים מזוקקים כפולים במשך שתי דקות בכל פעם.

בשלב זה, פיפטה 10 מיקרוליטר של בדיקה ppiB, dapB או htr2a באזורים שנבחרו. לאחר מכן, מכסים את מגש הלחות במכסה כדי למנוע אידוי של המגיב. מנערים בעדינות את השקופיות על השייקר האופקי במהירות נמוכה תוך כדי דגירה בחום של 40 מעלות צלזיוס בתנור למשך שעתיים.

לאחר מכן, שטפו את השקופיות פעמיים עם מאגר כביסה למשך שתי דקות בכל פעם. פיפטה 10 מיקרוליטר של מגיב ההגברה 1 על כל אזור שנבחר. מנערים ומדגרים את המגלשות בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן, שטפו את השקופיות פעמיים עם מאגר כביסה למשך שתי דקות בכל פעם.

פיפטה 10 מיקרוליטר של מגיב ההגברה 2 על כל אזור שנבחר. מנערים ומדגרים את השקופיות בחום של 40 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר מכן, שטפו את השקופיות פעמיים עם מאגר כביסה למשך שתי דקות בכל פעם.

פיפטה 10 מיקרוליטר של מגיב ההגברה 3 על כל אזור שנבחר. מנערים ומדגרים את המגלשות בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן שטפו את השקופיות פעמיים עם מאגר כביסה למשך שתי דקות.

פיפטה 10 מיקרוליטר של מגיב ההגברה 4 על כל אזור שנבחר. מנערים ומדגרים את השקופיות בחום של 40 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר מכן, שטפו את השקופיות פעמיים עם מאגר כביסה למשך שתי דקות.

פיפטה 10 מיקרוליטר של מגיב ההגברה 5 על כל אזור שנבחר. מנערים ומדגרים את השקופיות בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן, שטפו את השקופיות פעמיים עם מאגר כביסה למשך שתי דקות.

פיפטה 10 מיקרוליטר של מגיב ההגברה 6 על כל אזור שנבחר. מנערים ומדגרים את השקופיות בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לאחר מכן, שטפו את השקופיות שוב פעמיים עם מאגר כביסה למשך שתי דקות בכל פעם.

כעת, פיפטה 10 מיקרוליטר של המגיב האדום לכל אזור שנבחר. מניחים את השקופיות במגש הלחות על השייקר האופקי בטמפרטורת החדר, ומנערים בעדינות במהירות נמוכה למשך 10 דקות. לאחר מכן, שטפו את המגלשות פעמיים במים מזוקקים כפולים למשך 10 דקות בכל פעם.

יבש את השקופיות בחום של 60 מעלות צלזיוס בתנור למשך 15 דקות. לאחר מכן, הניחו את השקופיות בקסילן במכסה האדים למשך חמש דקות. לאחר מכן, פיפטה 20 מיקרוליטר של אמצעי הרכבה על בסיס קסילן על כל אזור שנבחר וכסו בכיסוי.