JoVE Encyclopedia of Experiments
מדעי המוח
0 צפיות • 3:26 דק' • July 8th, 2025
התחל עם מוחות מזבובי דרוזופילה טרנסגניים, המכילים סוגים שונים של תאי גליה המכילים מערכת רקומבינאז ספציפית לתא.
הוא מניע את הביטוי של חלבון פני התא המאוחה לאפיטופים אנטיגניים שונים על אותו סוג תאים.
טפל ברקמה עם קיבוע כדי להצליב חלבונים ולשמר את ארכיטקטורת הרקמה.
שטפו כדי להסיר עודפי קיבוע.
הוסף חלבונים חוסמים כדי להסוות אתרי קשירה לא ספציפיים כדי להפחית את צביעת הרקע.
דגרו על הרקמה עם קוקטייל נוגדנים ראשוני שנקשר לאפיטופים השונים המתבטאים בתאי גליה.
יש לשטוף כדי להסיר נוגדנים ראשוניים לא קשורים.
דגירה עם נוגדנים משניים מצומדים פלואורופור הנקשרים לנוגדנים הראשוניים.
יש לשטוף כדי להסיר נוגדנים משניים לא קשורים.
הרכיבו את המוח בתוך מרווח הדמיה והניחו כיסוי. המרווח יוצר תא לרקמה, ושומר על המבנה התלת מימדי שלה.
תאים שונים מאותו סוג גליה המסומנים בנוגדנים מצומדים פלואורופוריים שונים מאפשרים הבנה של אינטראקציות תא-תא.
העבירו את המוחות המבודדים באמצעות קצה פיפטה P10 לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה בנפח 200 מיקרוליטר עם תמיסה מקבעת. לעולם אל תטפל במוח באמצעות מלקחיים. דגירה על הרקמות המוגנות מפני אור. הימנע משאיבת המוח במהלך העברת תמיסות.
כדי להסיר את הקיבוע, השתמש בשלוש שטיפות או יותר של 15 דקות עם תמיסת כביסה. לאחר מכן, חסום את הרקמות בתמיסת חסימה למשך 30 דקות או יותר. לאחר מכן, החליפו את תמיסת החסימה בנוגדנים ראשוניים מדוללים בתמיסת שטיפה, ודגרו על המוח למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.
כדי להסיר את הנוגדנים העיקריים, השתמש בשלוש שטיפות של שעה בתמיסת כביסה. לאחר מכן, הוסיפו נוגדנים מצומדים פלואורופור משניים בתמיסת שטיפה, ודגרו על המוח למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס, או למשך 4 שעות בטמפרטורת החדר. כדי לשטוף לחלוטין את הנוגדנים הלא קשורים, השתמש בשלוש שטיפות של שעה בתמיסת כביסה, ולאחר מכן שטיפה ארוכה יותר עם PBS.
לאחר מכן, הרכיבו את המוח. הכן שני כיסויים עם מרווח הדמיה. במרווח, ועל הכיסוי הנוסף, יש למרוח 10 מיקרוליטר של מדיום הרכבה עם חומר נגד דהייה. לאחר מכן, בעזרת פיפטה P10, העבירו את המוח לכיסוי, והפקידו אותם ליד המדיום יחד עם כמה PBS. אל תתנו לרקמה להתייבש.
כעת, העבירו בזהירות את המוח למדיום ההרכבה, בעזרת הפיפטה. ולבסוף, העבירו אותם למדיום במרווח וסדרו אותם בעזרת מלקחיים. לאחר מכן, הסר את תוחם הדבק על המרווחים והצמד כיסוי. אבטח את הכיסוי במעט לחץ בעזרת מלקחיים והמשך מיד בהדמיה.
מאמר זה מפרט פרוטוקול לדימוי תאי גליה במוחות של Drosophila טרנסגנית באמצעות טכניקות של אימונופלואורסצנציה. השיטה מדגישה את החשיבות של שימור ארכיטקטורת הרקמה ומינימום של צביעת רקע לצורך ויזואליזציה מדויקת של אינטראקציות בין תאים.
צביעה אימונופלואורסצנטית ברזולוציה גבוהה של מוחות זבוב הדרוזופילה (*Drosophila*) מאפשרת דימיון מדויק של תאים בודדים מתתי-אוכלוסיות של תאי גליה, ובכך תומכת בהסרת סיכונים מכניסטיים בשלבים מוקדמים של גילויים בתחום הנוירוביולוגיה. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות על ידי מתן אפשרות לוויזואליזציה ישירה של אינטראקציות בין תאים וביטוי של סמנים ספציפיים לתתי-אוכלוסיות. שיטה זו מיועדת לסייע בקבלת החלטות לגבי תיקי פיתוח שבהן ביולוגיה גליאלית מהווה בסיס למסלולים רלוונטיים למחלה.
תהליך עבודה זה של אימונופלורסצנציה משתלב בשלבים המוקדמים של הגילוי ותיקוף המטרה, ומגשרי למסגור פרה-קליני ולסריקה פנוטיפית כאשר ביולוגיה גליאלית מעורבת.
סרטונים קשורים
0 צפיות
סרטונים קשורים
0 צפיות
סרטונים קשורים
0 צפיות
סרטונים קשורים
0 צפיות
סרטונים קשורים
0 צפיות
סרטונים קשורים
0 צפיות
סרטונים קשורים
0 צפיות
סרטונים קשורים
0 צפיות
סרטונים קשורים
0 צפיות
סרטונים קשורים
0 צפיות
עודכן לאחרונה: 29 אוגוסט 2026